超臨界流體萃取技術在創面修復中的研究進展

簡揚 何勇 魏在榮

【提要】 創面修復是復雜的病理生理過程。隨著對創面修復機制研究的不斷完善，以及各種新技術和新材料的應用，創面修復已取得了很大的進展。本文通過總結以二氧化碳為代表的超臨界流體萃取技術的特點、原理、影響因素以及在創面修復方面的研究進展，探討該技術在創面修復方面的發展前景，為今后超臨界流體萃取技術在創面修復方面的研究提供參考。

創面修復是多因素參與的復雜病理生理過程，包括炎癥、細胞增殖和重塑等過程。隨著醫療技術的進步，創面修復已取得了很大的進展，但仍面臨諸如燒傷后瘢痕、糖尿病足和靜脈性潰瘍等創面修復難題。近年來，以二氧化碳（Carbon dioxide，CO2）為代表的超臨界流體萃取（Supercritical fluid extraction，SFE）技術以無毒、萃取溫度低、環保等特點被廣泛用于化工工業[1]、食品工業[2]、制藥[3]、環保[4]等領域。然而，其作為一種新型技術在創面修復的研究中鮮有報道，本文將重點介紹SFE-CO2技術的特點、原理、影響因素，及其在創面修復中的研究進展，借此為創面修復提供更多的新思路。

1 SFE 的簡介

1822 年，Cagniard dela Tour 首次在實驗中發現了超臨界現象。1869 年，Thomas Andrews 用CO2研究超臨界現象，測定了CO2的臨界參數，并提出了沿用至今的“臨界點”概念[5]。在20 世紀70 年代，SFE 技術才迅速發展，并被廣泛應用于多個領域。我國SFE 技術起步較晚，在20 世紀90 年代，我國的SFE 技術才迅速發展起來。相較于其他萃取技術，由于采用了超臨界溶劑，SFE 技術在密度、擴散系數、黏度和介電常數等參數方面具有顯著優勢。因此，SFE 技術被廣泛應用于食品工業、化工工業、中醫藥有效成分提取、環境保護等方面。

1.1 超臨界流體的定義和特點

某一特定物質處于臨界溫度（TC）和臨界壓力（PC）以上狀態時，向該狀態氣體施加壓力，氣體不會液化，只是密度增加，具有類似液態的性質，同時還保留氣體的性能，這種狀態的流體定義為超臨界流體（Supercritical fluid，SCF）。SCF 的密度接近于液體，而黏度、擴散系數和導熱系數介于氣體、液體之間，但更接近于氣體。SCF 的低黏度和相對高的擴散系數，使其物質運送能力優于液體；能更容易穿透固體物質表面，提取效率更高。SCF 最顯著的特點是改變壓力和（或）溫度，液體密度隨之改變的同時溶解性能也發生相應的變化。

少數化合物能被用作SCF，其中CO2的臨界溫度和臨界壓力分別是31.06 ℃和7.39 MPa（表1）。作為應用最廣泛的SCF，CO2具有四大顯著性優點[6]：①對人體無害，對環境無污染；②室溫附近的臨界溫度，有助于萃取物生物活性成分的保留；③化學性質不活潑，在萃取過程中的無氧環境可避免活性成分發生氧化反應；④CO2極性小，尤其適用于非極性或極性較小物質的提取。

表1 SFE 常用溶劑的關鍵性質Table 1 Critical properties of common solvent used in SFE

1.2 SFE-CO2 的原理及影響因素

SFE-CO2 的原理是利用壓力和溫度變化對超臨界CO2流體溶解能力的影響，將超臨界CO2流體與含目標物的基質接觸，使其選擇性地萃取目標物，然后通過減壓、升溫的方法，解除CO2超臨界流體狀態，被萃取的目標物則完全或基本分離，進而實現分離純化的目的[7]。

SFE-CO2的影響因素較多，包括壓力、溫度、CO2流速、萃取時間、夾帶劑等[8-11]。壓力和溫度是SFE-CO2的關鍵參數之一，溫度恒定時，CO2流體的密度和溶解能力隨壓力升高而增強，但當壓力升高到某一特定值后，CO2的超臨界相密度隨壓力變化而減慢，導致CO2溶解性能反而降低。萃取率隨萃取溫度升高而增加，但多項研究已證實[12]，當溫度和壓力達到一定峰值時，萃取率隨溫度和壓力的升高反而降低，說明存在最適萃取溫度和壓力。

2 SFE-CO2 在創面修復中的研究進展

SFE-CO2作為一種綠色環保的新興技術，以其萃取溫度低、無毒無溶劑殘留、萃取效率高、可選擇性萃取等優點，逐漸被應用于創面修復的皮膚替代品制備、新型敷料研發、天然藥物有效成分萃取以及制劑產品質量提升等多個方面，并取得了一些研究成果。目前該技術在創面修復方面的研究主要有以下方面。

2.1 脫細胞生物材料

皮源是大面積創面修復時的一大難題，而皮膚替代品是很好的選擇之一。近年來，脫細胞真皮基質（Acellular dermal matrix，ADM）在臨床上被用于組織大面積缺損時創面早期覆蓋與后期整形，并取得了較好的效果。但也存在抗原性較高、膠原三維結構被破壞、缺乏血管網狀結構等問題，移植后成活率受到影響[13]。近期，Wang 等[14]報道了采用SFE-CO2技術從豬皮膚中制備ADM，所制備的ADM 抗原性進一步降低，在細胞毒性試驗、熱原試驗、哺乳動物基因突變試驗、鼠全身毒性試驗、皮膚內刺激試驗、皮膚敏感性試驗和肌肉植入研究等各項試驗中均顯示良好的效果。SFE-CO2技術制備的豬源ADM 具有良好的生物相容性，有利于加速創面的修復，有望解決目前ADM 面臨的抗原性高等問題。同一時間，Chung等[15]利用SFE-CO2技術除去豬脂肪組織中免疫性強的細胞內成分，研究發現經SFE-CO2處理的ADM 因無化學試劑處理過程而使真皮基質生物結構免受破壞，更有利于創面的修復。經SFE-CO2技術處理的細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）在除去免疫原成分的同時，也保留了有利于組織修復的氨基葡聚糖和生長因子等成分，為ADM 在創面修復和組織再生治療等方面的臨床應用開辟了新的研究思路[16]。

除了上述ADM 的制備外，SFE-CO2技術還被應用于制備其他多種脫細胞生物材料，包括脫細胞肌腱、韌帶、脂肪、角膜、骨組織等[16-20]。肌腱損傷常見，自體肌腱移植被認為是肌腱缺陷修復的金標準[21]。然而，其存在可用性有限、手術和康復時間長、供體部位損傷和潛在的功能缺陷等缺點[22]。Sun等[17]比較了SFE-CO2、γ 輻射和十二烷基硫酸鈉制備的脫細胞肌腱性能，雖然SFE-CO2（102 bar，39 ℃，3 h）制備的脫細胞肌腱性能優于另外兩種方法，但其并未完全實現脫細胞，這一缺點可以通過增加夾帶劑來解決。抽脂產生的脂肪組織常被視為醫療廢物處理，但其內富含豐富的ECM，是制備脫細胞ECM 很好的原材料[23]。Wang 等[16]使用SFE-CO2技術從抽脂獲得的脂肪組織中制備脫細胞外基質，發現膠原蛋白、生長因子等得到了極大保留，分別與脂肪組織來源的間充質干細胞、人臍靜脈內皮細胞、人角質細胞和人單核細胞白血病細胞共培養后發現，由此產生的脫細胞脂肪ECM 是一種可用于軟組織工程、血管生成和傷口愈合的生物活性表面涂層材料。盡管SFE-CO2技術已被報道用于多種脫細胞生物材料的制備，但僅有較少的研究系統地報道了壓力、溫度、CO2流速等因素對脫細胞生物材料性質的影響。

2.2 醫用敷料質量改進與研發

醫用敷料覆蓋于創面表面，在創面修復過程中，為受損的皮膚作暫時性屏障保護作用，提供有利于創面修復的環境。目前，臨床應用的醫用敷料包括傳統紗布敷料（紗布、繃帶和棉球）、高聚物吸水溶脹而成的水凝膠敷料、聚氨酯泡沫性敷料和聚乙烯等高分子彈性體制成的薄膜型敷料[24]。理想的醫用敷料應無毒、無抗原性，不易發生組織粘連，能為創面維持一個濕潤環境，透氣性能良好，促進愈合過程中的細胞增殖，在屏蔽微生物的同時有利于創面滲出物的迅速排出[25]。

2.2.1 膠原蛋白醫用敷料

膠原蛋白在創面修復過程的不同階段起著重要作用。創面修復早期，暴露在血液中的膠原纖維在受損的血管壁處誘導血小板與其粘附，從而使血小板凝聚而發揮止血作用。膠原蛋白醫用敷料在創面修復中發揮的作用：吸收傷口滲出液和不利于傷口愈合的因子，保護組織修復物質不被基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）降解而發揮競爭性底物作用，防止繼發性細菌感染和抑制蛋白酶活性，以及調節成纖維細胞、巨噬細胞和上皮細胞遷移促進創面修復等作用[25]。為降低膠原蛋白敷料的抗原性，制備高質量、無溶劑殘留、無毒膠原蛋白，Deviese 等[26]嘗試利用SFE-CO2從骨中提取膠原蛋白，通過質譜的方法驗證SFE-CO2的可行性。與傳統的提取方法相比，SFE-CO2的提取效率更高、降低免疫原性雜質能力更強。Wang 等[14]利用SFE-CO2從豬皮膚中萃取膠原蛋白，研究發現所萃取的膠原蛋白具有與人皮膚Ⅰ型膠原蛋白相似的化學性質，無毒、生物相容性良好，為創面修復醫療敷料提供了高質量的原料。

2.2.2 新型醫用敷料的研發

傳統的紗布敷料易產生傷口粘連，透氣性能較差，不利于創面修復。通過新型材料來靶向調控創面微環境是目前創面修復醫用敷料研發的一大重要方向。慢性創面的微環境包括高氧化應激、持續的炎癥、生長因子少、血管功能受損、缺氧等，通過新型材料來調控這些途徑，使其向有利于創面修復的方向發展已取得了較好的效果。Morgado 等[27]使用SFECO2輔助技術將布洛芬負載到聚乙烯醇/殼聚糖（PVA/CS）敷料上，研究證實該敷料能抑制過度的炎癥反應，更有利于創面愈合。

SFE-CO2技術也可用于制備攜帶具有抗菌活性藥物的敷料。Markovic 等[28]運用SCF-CO2作為工作流體，用百里香酚浸漬聚丙烯（PP）和電暈改性PP 非織造材料制作了具有抗菌活性的敷料，并證實二者都能最大程度地減少微生物，更有利于創面的愈合。SFE-CO2在新型敷料制備中展現了較好的效果，其臨界溫度低的特點更有益于在制備生物活性材料的同時保留其生物活性。

泡沫敷料是一種常用的創面敷料，溶劑殘留和高溫是傳統制備工藝的主要缺點[29]。近年來，SFE-CO2也被用作物理發泡劑制備聚合物微孔材料[30]，其能在不影響力學強度的前提下，提高孔隙率與貫通性并能復合多種生物活性物質[31]。Milovanovic 等[32]使用SFE-CO2制備了聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）作為百里香酚的藥物控釋系統，在37 ℃PBS 溶液中百里香酚能釋放長達3～6 周。殼聚糖常被用于制備多種生物材料，是新型醫用敷料很好的原材料[24]。Lovskaya等[33]采用SFE-CO2制備一種具備止血功能的殼聚糖氣凝膠，其具備較高的內表面積和孔隙率（分別高達300 m2/g 和98%），能迅速在傷口周圍形成致密的止血塊，止血效果穩定，可用于大面積止血。此外，SFE-CO2也被用于ε-己內酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚乳酸、聚己內和聚環氧乙烯等多孔材料的制備[34-35]。雖然SFE-CO2發泡技術具備無毒、無溶劑殘留、低溫等優點，但泡孔密閉是其面臨的難題[31]，可通過改變壓力、溫度、降壓速率等來控制。

納米材料是近年來出現的新興材料，納米纖維能較好模擬細胞外基質、隔絕外界環境和避免炎癥的發生，常被用作敷料原料[36]。Darpentigny 等[37]通過SFE-CO2技術制備了一種具備高吸水性能的纖維素納米纖維氣凝膠，在制備過程中發現，與冷凍干燥法相比，超臨界干燥法似乎對纖維素納米纖維網的保存效果更好，并產生了更精細的結構。Vasil'kov 等[38]將微晶纖維素采用超臨界干燥法制備成氣凝膠，并與納米銀混合制成了一種新型復合材料，通過對其結構特征及其功能特性進行檢測后，認為其可用作傷口愈合或水凈化的材料。Jia 等[39]使用SFE-CO2技術制備了一種二氧化硅納米粒子，其載藥量＞40%質量分數，將其與聚乙烯醇和殼聚糖組成的膜基質相結合制成一種創面敷料，其對金黃色葡萄球菌具有長期抗菌作用，而對小鼠成纖維細胞無毒性作用。盡管SFECO2技術可用于微孔材料、納米材料等新興材料的制備，但仍需對其制備工藝進行優化，建立相應的數學模型，以指導新材料的制備。

2.3 天然藥物有效成分萃取

一直以來都有中醫藥治療皮膚慢性潰瘍的醫學文獻報道，并積累了豐富的臨床經驗，如“提膿去腐”、“祛腐生肌”、“肌平皮長”等。很多中醫藥有效成分被用于創面修復方面的臨床研究和應用，但這些有效成分多是用傳統萃取技術獲取，存在溶劑殘留等缺點。SFE-CO2以低溫、無氧環境和無需有機溶劑萃取、萃取能力和效率高等優點，越來越多地被應用到中醫藥有效活性成分的提取中，具有創面修復功效的SFE-CO2萃取活性成分不斷地在試驗和臨床應用上得到證實。

沙棘果是沙棘屬植物的果實，具有抗氧化、抗菌、免疫調節、細胞保護和組織修復作用[40]。臨床上采用沙棘果汁治療燙傷，在緩解患者疼痛、促進創面修復等方面顯示出良好的治療效果[41]。Upadhyay 等[42]利用SFE-CO2低溫、無氧環境和無需有機溶劑萃取等特點，以降低熱應力和氧化反應對沙棘果生物活性的影響。在治療Ⅲ度燒傷的大鼠試驗中發現，沙棘果通過上調肉芽組織中的MMP-2、MMP-9、Ⅲ型膠原蛋白和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，顯著降低創面肉芽組織的還原型谷胱甘肽含量和活性氧的產生，促進創面修復過程中的創面收縮、羥脯氨酸、氨基己糖和總蛋白含量提升。SFECO2萃取的沙棘果提取液不僅能提高創面修復效果，還能降低毒副作用。王養正等[43]在研究SFE-CO2萃取的沙棘籽油和沙棘果油對大鼠皮膚燙傷和燒傷的影響時，發現沙棘籽油和沙棘果油均能明顯減輕創面的局部紅腫癥狀和分泌物滲出，促進創面修復。

蝦青素（Astaxanthin）是一種酮類胡蘿素，在創面修復的氧化應激、炎癥反應以及細胞凋亡等方面發揮著抗氧化、抗炎癥和抗凋亡作用[44]。Chou 等[45]利用SFE-CO2（壓力：4 500 psi；溫度：50 ℃；流速：6.0 nL/min；提取時間：20 min；夾帶劑：乙醇）從雨生紅球藻中提取蝦青素，將蝦青素提取物應用到人皮膚成纖維細胞的研究中。結果發現，蝦青素提取物通過抑制MMP1 和MMP3 mRNA 基因表達，誘導MMPs 拮抗劑TIMP1 蛋白的表達，使膠原蛋白增加而促進創面修復。蝦青素提取物還能促進VEGF 增殖，發揮修復皮膚損傷的作用。

Juthaporn 等[46]評價了紫莖澤蘭的SFE-CO2提取物促進Ⅱ級燒傷創面修復的效果，結果表明通過SFE-CO2萃取的紫莖澤蘭花葉提取物可通過縮短炎癥階段、增加膠原蛋白含量并刺激成纖維細胞在創面愈合中的增殖和遷移，進而促進創面修復。

2.4 提升天然藥物制劑質量

積雪草中藥膏劑臨床常用于皮膚感染，發揮抗炎作用，有利于感染部位的創面修復[47]。然而，傳統浸漬法萃取物中的植物色素會隨時間自然褪色，導致制劑在顏色上存在質量差異。Ruksiriwanich 等[48]引入了SFE－CO2技術改進積雪草葉萃取方案，消除了天然藥物制劑中提取物色素差異，改善其體外傷口愈合活性。同時，SFE－CO2積雪草萃取物中的總三萜類化合物和總三萜苷的含量明顯高于傳統浸漬法提取物中的含量，而且SFE－CO2積雪草萃取物在創面修復過程中顯示出較高的細胞遷移和血管數目，顯著促進創面修復。

3 SFE-CO2 在創面修復研究中的展望

SFE－CO2萃取技術作為一種具有廣闊應用前景的新型技術，是符合當今社會可持續發展潮流的“綠色工藝”，具有無毒、萃取效率高、萃取溫度低等優點。目前主要應用于食品工業、化工工業、中藥有效活性成分提取等方面，但由于CO2的極性較小，對極性較大的物質萃取效率較低，需要添加助溶劑，如脫細胞生物材料制備過程中通常使用乙醇作為助溶劑[19]。此外，在國內外少有該技術在創面修復方面的研究報道，仍需加大該技術在創面修復方面的研究和應用，例如制備多種脫細胞生物材料、提取及純化中藥活性成分等，以促進創面修復的多元化和高效化。未來可從以下方面應用SFE－CO2技術來促進創面的高效愈合及精準修復。第一，制備脫細胞生物材料，在不影響生物相容性的條件下對材料改性或添加功能基團；第二，制備新型生物材料，如利用發泡技術制備多種具備藥物控釋功能的敷料；第三，提取中藥活性成分，改善藥劑質量；第四，運用數學模型，從理論上分析原材料與各工藝因素間的關系，尋找最佳制備條件，以指導新材料的制備。相信隨著對SFE－CO2技術認識和研究的進一步深化，這一新型技術將得到更加廣泛和深入應用，對醫療技術的進步將產生深遠影響，為更多的患者帶來福音。