動靜脈畸形動物模型的研究及應用進展

戴夢婷 崔杰

【提要】 動靜脈畸形（Arteriovenous malformations，AVM）是一類較少見且高風險的血管畸形。盡管目前血管內治療、手術治療及聯合治療已應用于該疾病的治療，但風險較高，且效果不一。近幾十年來，已有多種實驗模型被用于AVM 發病機制、血流動力學變化、組織學等的研究，以期加深對該疾病的認識，從而探索更有效的治療手段。但目前仍缺乏能完美模擬人體各種動靜脈畸形的動物模型。本文對近年來AVM 相關動物模型的研究及其應用的優缺點進行綜述。

動靜脈畸形（Arteriovenous malformations，AVM）是一種高流量的先天性脈管畸形，因動、靜脈之間缺乏正常的毛細血管床而直接溝通，形成眾多微小的動靜脈瘺，從而造成迂曲、擴張的病灶[1]。AVM 發病率不高，顱內AVM 的發生率約為1/10 000，而顱外AVM 是顱內的1/20。顱外病灶多表現為局部的皮膚紅斑，皮溫高，可觸及搏動及震顫，病情進展可出現頑固性潰瘍及感染、反復出血，嚴重者因長期血流動力學異常致心力衰竭[2]。顱內AVM 則表現為自發性出血、頑固性頭疼及癲癇等[3]。

AVM 的治療復雜且極具挑戰性。優化治療、提高療效的關鍵在于了解動靜脈畸形的發病機制及發展過程，目前缺乏理想的實驗模型用于研究，因此建立合適的實驗模型十分重要。動物模型按產生的原因分類為自發性實驗動物模型、誘發性實驗動物模型。自發性實驗動物模型又分為突變系的遺傳性疾病動物模型、免疫缺陷動物疾病模型、遺傳性疾病模型和自發腫瘤疾病動物模型。誘發性實驗動物模型又分為物理誘發方法、化學誘發方法和生物誘發方法。近30 年來，人們建立了各種各樣的AVM 動物模型，大多是誘發性實驗動物模型，都是通過手術或穿刺等誘導方式產生的，各有其優缺點。近來又產生了AVM 的數字模型用于治療的研究，卻不適用于病因和發病機制的研究?？傮w來講，自發性實驗動物模型的研究偏少。本文就現有的AVM 動物模型進行綜述，以期為進一步研究AVM 的動物模型提供思路。

1 動靜脈畸形動物模型的發展回顧

最早的AVM 動物模型在1978 年就已有報道[1]，該模型基本能達到AVM 的生理特性，但在研究血流動力學、組織學改變等方面存在局限性。此后建模方式不斷改進，直至1999年Bourdeau 等[4]開始對AVM 的基因模型進行了嘗試性研究并獲得成功，以后更多的基因模型被報道，但沒有一個模型能夠完整還原AVM 的不同發病機制。

2 動靜脈畸形動物模型的研究進展

2.1 血流動力學研究模型

用物理方法復制人AVM 血流動力學變化是研究AVM病理生理和完善血管內技術的必要條件。大多數模型包含了動靜脈分流和（或）畸形血管團。這類動物模型較成熟，多用于新的治療方法的開發和研究。

2.1.1 豬模型

豬頸部血管較粗大，在進行血管吻合時較容易操作，且有一個微血管網（豬顱底奇網），血管造影表現類似于人AVM病灶中的畸形血管團，可用于模擬病灶。

1994 年，Chaloupka 等[5]從豬眼眶前下方，經角膜內球后入路，在海綿竇造影的協助下穿刺入海綿竇，在顱底微血管網和海綿竇之間建立一個持續的動靜脈分流。該模型在操作時容易引起眶內損傷并損害微血管網，且由于明顯的炎癥反應和成纖維細胞反應，該瘺口常在5～7 d 內自行閉合。但該模型對于改進血管內技術和試驗新的栓塞劑具有較好的作用。Massoud 等[6]通過微導管，使用彈簧圈先阻塞右側的枕動脈、咽升動脈肌支，并用球囊栓塞右側頸外動脈，然后將右側的頸總動脈和頸外靜脈行側-側吻合，結扎右側頸總動脈的近心端及同側頸外靜脈的遠心端，最終成功出現異常的血管團和動脈靜脈之間的血管分流，模擬出了人AVM 現象。但該模型操作復雜，在行頸總動脈和頸外靜脈側-側吻合時，血管吻合口之間因牽拉而變扁，容易引起吻合口栓塞。Klisch 等[7]將豬的左頸總動脈和頸外靜脈端-端吻合，并在咽升動脈與枕動脈根部遠端位置結扎左側頸外動脈，增加了血流量，減少了自發性血栓形成。血管造影顯示在椎動脈與左側頸外靜脈之間同時形成了AVM 及動靜脈瘺（AVF）。Siekmann 等[8]穿刺頸總動脈并在咽升動脈起始處置入導管，在穿刺點近端結扎頸總動脈，導管的針芯打開后可作為引流靜脈，對側的咽升動脈作為供血動脈，顱底微血管網作為病灶。該模型操作簡單，可用于監測血流動力學的變化。Papagiannaki 等[9-10]通過閉塞左頸總動脈（CCA）和頸外動脈建立了具有腦AVM 組織學特征的血管生成模型，并用該模型進行了抗血管生成藥物貝伐珠單抗的研究。Touma 等[11]通過豬頸總動脈與頸外靜脈側-端造瘺的方式構建模型，并用于骨髓間充質干細胞治療AVM 的研究。豬微血管網還可直接模擬病灶，用于新型栓塞材料的研究[12-14]。此外，Jones[15]還利用豬顱底血管網實驗來觀察高強度聚焦超聲（HIFU）消融AVM 的效果。然而，利用豬顱底血管網來構建的模型均位于硬腦膜外，無法模擬出腦實質繼發性出血的臨床癥狀。

2.1.2 鼠模型

鼠模型可用于顱內AVM 的研究。經典的有Morgan 的模型[16]，通過結扎大鼠右側頸總動脈和頸外靜脈的近心端，將兩者的遠心端行端-端吻合，同時結扎頸外動脈，阻止顱外動脈向顱內供血。瘺口通暢時，周圍腦組織處于低灌注狀態，瘺口閉塞時，腦組織充血水腫。對該模型檢測發現，吻合側腦血流量減少25%～50%，慢性低灌注狀態下可見病灶處的毛細血管密度增加，有些細小的毛細血管缺乏正常的星形細胞足突，提示血腦屏障被破壞。1991 年，Bederson 等[17]將大鼠右側頸總動脈近心端與頸外靜脈遠心端吻合，殘端結扎，右側頸總動脈的血液經吻合口流入同側頸外靜脈，然后經頸外靜脈反流入橫竇，最后經對側頸外靜脈回流。1 周后行病理檢查發現大鼠腦組織嚴重水腫，有多處靜脈栓塞、蛛網膜下腔出血。此模型模擬了人AVF 中腦血管盜血和靜脈高壓特征，并強調這兩個因素在AVF 病理生理中的作用[18]。2004 年，Yassari等[19]在鎖骨下靜脈匯合處結扎左側頸外靜脈（EJV），并與頸總動脈行端側吻合，血管造影和血液動力學檢查表現出與人類AVM 相似的特征。

大鼠模型的病灶存在動脈化靜脈，更接近人AVM 的特征，更多地被用在立體定向放射治療的研究中。高劑量輻射束聚焦于AVM 引起局部DNA 損傷，可引發內皮細胞和平滑肌細胞增殖，并最終形成血栓。曾有研究報道，可溶性組織因子（Soluble tissue factor，sTF）和低劑量脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）在大鼠AVM 模型中選擇性地誘導輻照瘺管血管中血栓形成，而輻射區域外的正常血管對LPS 和sTF 有抵抗作用，這可能與組織因子途徑抑制劑、血栓調節蛋白、sTF的螯合作用有關[20]。為了進一步驗證放射治療是否可以誘導分子改變，作為血管靶向，使用Yassari 模型，發現放射線可誘導內皮黏附分子如E-選擇素的表達，成功地在放射治療后的動物模型中誘導血栓形成[21]。

2.1.3 其他的動物模型

除上述模型外，還有利用羊、兔等動物的頸動脈-頸靜脈吻合建立動物模型。此外，有研究選擇犬作為實驗動物，切取一段顳淺動脈及一塊該動脈的分支所供血的顳肌，用該段顳淺動脈在大腦中動脈的分支和背側矢狀竇之間形成旁路，產生動靜脈分流[1]。

2.2 血管發育生物學模型和AVM 自發性動物模型

目前認為，血管生成和動靜脈分化異常與AVM 的發生發展息息相關。許多細胞因子及基因被證實在AVM 的形成、生長及破裂出血中有重要作用。

2.2.1 血管生成相關細胞因子

研究發現，很多細胞因子參與了血管生成過程，包括VEGF 家族和Ang 家族等。對AVM 病灶的組織病理研究發現，VEGF、Ang-2 及配體Tie-1 和Tie-2 均高表達[22]。Vates等[23]將VEGF 或Ang-2 注入鵪鶉胚胎正在發育的視頂蓋腦室，或聯合注射VEGF 和Ang-2，以研究這兩種生長因子的累積效應。發現VEGF 和Ang-2 水平的升高均可導致大腦中血管發育異常，出現擴大和變形，甚至出現眶后和腦室內出血、畸形等，這與AVM 在某種程度上的改變相似。在該模型上應用VEGF 的貝伐珠單抗可減少異常血管的數量。

2.2.2 Notch 信號通路相關模型

Murphy 等[24]應用四環素調控系統誘導小鼠胚胎，血管內皮細胞持續激活Notch-4 受體，可獲得類似AVM 的改變，包括動靜脈分流及血管的擴張，25%的突變表現出神經功能障礙（包括共濟失調及癲癇發作）。此外，通過調低Notch-4 受體的表達可減少異常增粗的血管，逆轉相關神經系統疾病的表現。Yao 等[25]建立了MGP 基因缺失小鼠模型，MGP 基因缺失通過激活Alk1 引起小鼠腦AVM。這種激活增強了Notch的活性，并通過誘導Notch 配體Jagged 1 和2 來破壞內皮細胞的分化。進一步的研究證實，減少Jagged 1、2 的表達可阻止分化的中斷和AVM 的形成。Notch 信號通路與AVM 的發生、發展有著重要聯系，利用該信號通路建立合適的動物模型，為研究AVM 的發病機制及治療方法提供了新思路[26]。

2.2.3 遺傳性出血性毛細血管擴張癥

遺傳性出血性毛細血管擴張癥（Hereditary hemorrhagic telangiectasia，HHT）是一種常染色體顯性遺傳病，主要臨床癥狀包括鼻出血、皮膚和黏膜的毛細血管擴張以及肺、肝和腦等主要器官的動靜脈畸形[27]。HHT 中相關突變基因均累及轉化生長因子β 信號通路，包括與HHT1 相關的ENG 基因突變，HHT2 相關的ACVRL1 基因突變[28]。最初建立的ENG－/－小鼠模型存在心血管缺陷，且在胚胎中期死亡。ENG－/－胚胎的卵黃囊包含大而易碎的血管，原始心臟墊（即心臟瓣膜的原基）有缺陷，并導致大血管成熟延遲，周圍的血管平滑肌細胞（vSMC）較少，ACVRL1－/－小鼠也有類似表現[4]。隨后的研究中雜合Eng+/－和Alk1+/k小鼠出現HHT 樣血管病變，如鼻出血、毛細血管擴張等，但顱內的自發病變并不明顯。在雜合Eng+/g或Alk1+/k1成年小鼠的大腦中施加VEGF 的刺激，可誘導腦微血管發育不良，獲得更顯著的AVM 模型[29]。這些研究表明，在雜合模型中，血管生成刺激對于血管發育不良的發展是必需的。

為了建立一個更能反映出生后HHT 表型的模型，利用Cre/LoxP 重組系統的條件敲除技術，在計劃的時間或預期的細胞中刪除目標基因來構建基因敲除模型[30]。用SM22MERGE 轉基因小鼠將Eng 在小鼠胚胎發育階段敲除，加上VEGF 的刺激，在小鼠中樞神經系統出現了類似人類的AVM 病變，包括動靜脈分流和自發性出血[31]。Walker 等[32]通過向Alk12LoxP/2LoxP和Eng2LoxP/2LoxP的基底節注射表達Cre 和VEGF 的載體，成功地在成年小鼠大腦中產生了類似人AVM的病變。此外，徐宏治等[33]則利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術，條件性敲除ACVRL1 基因誘導腦動靜脈畸形的生成，進一步的腦組織標本病理分析驗證了敲除ACVRL1 基因來建立中樞神經系統動靜脈畸形動物模型的可行性。

較小比例的HHT 患者中有SMAD4 轉錄因子突變。內皮細胞（EC）特異性SMAD4 敲除小鼠模型（稱為SMAD4－iECKO）中，SMAD4 的誘導缺失會導致各種血管異常，包括AVM 的形成。該模型中血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）表達水平降低。該研究為HHT 領域提供了一個新的模型，并提供了TGFβ 和VEGF 通路可能在AVM 發病機制中相互關聯的證據[34]。后續研究發現，SMAD4 的缺失導致ECs 中血管生成素2（ANGPT2）的轉錄增加，導致AVM 的形成，血管管徑增加，以及EC 形態改變。阻斷ANGPT2 的功能可緩解這些血管表型，進一步研究表明ANGPT2 是TGFP 在AVM 形成中的重要下游介質。因此，針對ANGPT2 功能的替代治療方法可能對減輕遺傳性出血性毛細血管擴張癥狀（如AVMs）有治療價值[35]。

2.3 散發性AVM 相關基因模型

Bameri 等[36]總結腦動靜脈畸形存在著KRAS/BRAF 突變。模型研究顯示，RAS/RAF 通路抑制劑可以對中樞神經系統動靜脈畸形進行靶向治療。在此基礎上，Park 等[37]用致瘤性KRAS 選擇性地過度激活內皮細胞，誘導小鼠形成腦動靜脈畸形。Al－Olabi 等[38]在顱外散發型高流量脈管畸形中分別檢測到了KRASQ61H,G12V、BRAFV600E和MAP2K1 的鑲嵌突變。基于該 發現，Al－Olabi 等將BRAFV600E、MAP2K1 分別注 射 到 斑 馬魚單細胞胚胎中，誘導形成了斑馬魚動靜脈畸形模型，表現出血管形成紊亂、血流障礙等病理改變；且用BRAF 抑制劑處理該模型，可發現血流障礙得到了改善。建立基于上述相關基因的AVM 動物模型將極大提升對AVM 發生發展機制的準確認識，也為靶向治療的研發提供新思路。

2.4 抗體模型

BMP9 和BMP10 是BMPR2/TGF－β 通路的內皮細胞特異性配體，可以阻斷整個信號通路。在哺乳期雌性小鼠腹腔注射抗BMP9/10 抗體，經乳腺傳遞給幼鼠，可在幼鼠血液循環中檢測到該抗體，并在視網膜中誘導AVM 樣病理改變[39]。該模型已被用于驗證他克莫司、雷帕霉素和尼替達尼對不同解剖部位AVMs 的治療作用[40]。

3 存在問題與展望

機械性的誘發性實驗動物模型存在缺陷，如大鼠腦部的腦血管太小，外科操作難度大，且很難獲得詳細的血管造影數據；豬腦血管系統中的微血管網可用于血管造影研究，但其缺乏動脈化靜脈，不適用于動靜脈畸形的生物學研究。遺傳基因動物模型的AVM 是自發形成的，更接近于人AVM 的自然病程，故更適用于發病機制及藥理學等方面的研究。但病變在大小和位置上缺乏均勻性和可重復性，且操作過程復雜、擴展性強、耗時長。

AVM 的建模方式多種多樣，但至今仍然缺乏完整的由病因而制作的理想模型，以用于AVM 發生發展機制、血流動力學、治療方式等的研究，且目前已有的動物模型大部分是用于顱內動靜脈畸形的研究，顱外動靜脈畸形的動物模型極其少見。因此，相關研究應聚焦于進一步完善已有的模型，并開發新的自發性動物模型用于研究。