增強型綠色熒光蛋白標記膀胱癌外泌體的構建及其體外示蹤作用

陳輝 侯愛華 王培培 梅曉峰

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥發病率中排第十[1]。外泌體是直徑約40～160 nm 的細胞外囊泡，起源于細胞內吞作用形成的早期內體，而后在其他細胞內囊泡和細胞器的相互作用下被釋放到細胞外環境中[2]。外泌體的膜結構為磷脂雙分子層，膜上含有多種蛋白質和脂質，外泌體內部也含有多種生物活性分子，如RNA、脂質和蛋白質等[3－4]。細胞通過外泌體在細胞間傳遞生物活性分子，進行信息交流[5]。已有研究表明，外泌體與膀胱癌的發生發展、侵襲轉移、診斷和治療密切相關[6]。

為了明確外泌體的體內外分布狀況，現已開發出多種標記物用于外泌體的示蹤，目前外泌體的標記物主要有熒光染料、熒光蛋白、熒光素酶和無機熒光納米材料等。熒光染料是目前最常用的外泌體示蹤標記方法，其中親脂性染料（如DiR、DiI、PKH26、PKH67 等）是使用最多的標記方法。雖然該方法操作簡單，但限于目前的提取方法，外泌體中會有脂蛋白雜質的存在，親脂性染料標記外泌體的同時也會與脂蛋白結合；另外，親脂性染料標記外泌體后，無法將未結合的親脂性染料與外泌體完全分開，使外泌體的示蹤產生假陽性結果[7-9]。無機熒光納米材料標記外泌體具有高靈敏度和高時空分辨率的特點，但是需要特定的昂貴的儀器才能檢測，如正電子發射斷層掃描儀、全自動γ 計數儀等[10]。由于熒光染料在標記外泌體的過程中會對實驗結果造成干擾，且無機熒光納米材料的檢測儀器不具有通用性，因此本研究選擇熒光蛋白進行外泌體的示蹤。

人外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）主要包括70%～90%淋巴細胞、10%～30%單核細胞和1%～2%樹突細胞。膀胱癌組織微環境中存在多種免疫細胞，如腫瘤相關巨噬細胞、CD8+T 細胞、調節性T 細胞、樹突細胞、髓源性抑制細胞等[11]。邵劍鋒等[12]發現，膀胱癌組織微環境中CD163+/CD206+單核巨噬細胞異常增高，且該群細胞與腫瘤進展密切相關。Chen 等[13]發現，單核細胞在膀胱癌組織區域可進行M2 極化并分化。目前，膀胱癌生物學行為與免疫細胞之間的關系尚未明確，本研究初步探討了膀胱癌外泌體與PBMC 之間的聯系。

本研究通過將CD63 基因插入到pLVX-EGFPpuro 慢病毒載體中，構建出表達CD63-EGFP 融合蛋白的pLVX-CD63-EGFP 重組質粒，將重組質粒轉染到293T 細胞中，得到CD63-EGFP 慢病毒，用CD63-EGFP 慢病毒侵染膀胱癌5637 細胞，篩選出穩定表達CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌細胞株，提取其外泌體進行鑒定，最后將EGFP 標記的膀胱癌外泌體或膀胱癌細胞與人正常膀胱上皮細胞SVHUC-1 和PBMC 共培養，探討SV-HUC-1 和PBMC對膀胱癌外泌體的攝取情況。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI-1640 培養基、DMEM 培養基、胰蛋白酶、青鏈霉素、嘌呤霉素、Ficoll 分離液和Transwell 小室（北京索萊寶科技有限公司），FBS（Biological Industries 公司，以色列），無外泌體FBS（SBI 公司，美國），TRIzol 裂解液（Life Technologies 公司，德國），逆轉錄試劑盒（Thermo Fisher 公司，德國），DNA 聚合酶、EcoR Ⅰ酶、Xho Ⅰ酶、T4 DNA 連接酶（TaKaRa公司，日本），PEI 和聚凝胺（Sigma 公司，美國）。

兔抗人CD63 抗體、兔抗人HSP70 抗體和兔抗人Lamin B1 抗體（Abcam 公司，英國），山羊抗兔抗體（Proteintech 公司，美國）。pLVX-EGFP-puro、psPAX2、pMD2.G、293T 細胞系、5637 細胞系和SVHUC-1 細胞系由梅曉峰教授惠贈。PCR 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。CD63 上游引物：CGCGAATTCATGGCGGTGGAAGGAGGAATG；下游引物：CGCCTCGAGGCATCACCTCGTAGCCACTTC。

1.2 方法

1.2.1 構建pLVX-CD63-EGFP 重組質粒

體外培養5637 細胞，用TRIzol 裂解液提取細胞RNA，逆轉錄得到cDNA，逆轉錄體系：5× Reaction Buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAid RT（200 U/μL）1 μL，Oligo（dT）18 primer 1 μL，RNA 1 μg，加無核酸酶水至20 μL；反應條件：42 ℃60 min，70 ℃5 min，1 個循環。以cDNA 為模板，PCR 反應擴增CD63，PCR 反應體系：5× PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，CD63-F（10 μmol/L）1 μL，CD63-R（10 μmol/L）1 μL，CD63 50 ng，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL，加無核酸酶水至50 μL；反應條件：98 ℃1 min，1 個循 環，98 ℃10 s，55 ℃15 s，68 ℃1 min，30 個 循環，膠回收CD63 DNA。用EcoR Ⅰ酶和Xho Ⅰ酶酶切CD63 DNA 和質粒pLVX-EGFP-puro，膠回收酶切片段。用DNA 連接酶將CD63 酶切片段連入質粒pLVX-EGFP-puro 中得到pLVX-CD63-EGFP 重組質粒，連接條件：25 ℃，2 h。將重組質粒轉化入DH5α 感受態細菌中，轉化條件：42 ℃，90 s。通過含100 μg/mL Amp 的LB 平板篩選出陽性菌落，挑取單個菌落搖菌提取質粒，進行Xho Ⅰ酶和EcoR Ⅰ酶雙酶切鑒定，并由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，得到pLVX-CD63-EGFP 重組質粒。

1.2.2 細胞轉染

將293T 細胞按3×105個/孔的密度接種到6 孔板中，24 h 后更換為2 mL DMEM 基礎培養基；取兩個EP 管，加入250 mL Opti-MEM 培養基，一個加入4 μg 混合質粒（pLVX-CD63-EGFP:psPAX2:pMD2.G=4:3:2），另一個加入12 μg PEI，靜置10 min；將含有PEI 的Opti-MEM 培養基加到含有混合質粒的培養基中，靜置20 min；把質粒-PEI 混合物加到細胞培養基上清中；8 h 后更換為2 mL DMEM 完全培養基；48 h 后收集上清，500×g 離心5 min，用0.45 μm過濾器過濾上清，放入-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 慢病毒侵染膀胱癌細胞

將5637 細胞按3×105個/孔接種到6 孔板中，24 h 后更換為1 mL 含8 μg/mL 聚凝胺的RPMI-1640 完全培養基，加入1 mL 病毒上清液；24 h 后更換為2 mL RPMI-1640 完全培養基；48 h 后，用含2 μg/mL 嘌呤霉素的RPMI-1640 完全培養基篩選表達CD63-EGFP 融合蛋白的5637 細胞。

1.2.4 超速離心法提取外泌體

用不含外泌體的RPMI-1640 完全培養基培養5637 細胞，收集上清；4 ℃，300×g 離心10 min，收集上清；4 ℃，2 000×g 離心10 min，收集上清；4 ℃，10 000×g 離心30 min，收集上清；4 ℃，100 000×g 離心70 min，棄上清；加入PBS 重懸沉淀，再次4 ℃，100 000×g 離心70 min，棄上清，收集沉淀，加入100 μL PBS 重懸，放入4 ℃冰箱中保存。

1.2.5 外泌體的鑒定

1.2.5.1 透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態

將15 μL 外泌體樣本加在銅載網表面，靜置150 s；滴加15 μL 3%醋酸雙氧鈾溶液在銅載網表面，染色3 min，用濾紙吸去上層多余液體；滴加30 μL超純水在銅載網上洗去多余的醋酸雙氧鈾，用濾紙吸去上層多余液體；室溫干燥2 h 后拍照。

1.2.5.2 粒徑分析

用PBS 將15 μL 外泌體樣本稀釋為1 mL，震蕩混勻，緩慢注入到樣品池中，測定外泌體的粒徑大小。

1.2.5.3 Western blot 檢測外泌體的標志蛋白

將5637 細胞在含1 mmol/L PMSF 和1%蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液中冰上裂解30 min，裂解液4 ℃，5 000×g 離心15 min，取上清。用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將外泌體和細胞裂解液在100 ℃下煮沸10 min，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并將蛋白轉移到PVDF 膜上，PVDF 膜在BSA 封閉液中封閉2 h，與相應的抗體4 ℃孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗室溫下孵育2 h。使用以下抗體：抗CD63（1:1 000）、抗HSP70（1:1 000）、抗Lamin B1（1:1 000）、山羊抗兔IgG 抗體（1:5 000）。最后，將PVDF 膜用標準ECL 試劑處理檢測。

1.2.6 EGFP 標記的膀胱癌外泌體與SV-HUC-1 共培養

把蓋玻片放入6 孔板中，將SV-HUC-1 按照2×106個/孔的密度接種到板中，培養8 h 后向培養基中加入EGFP 標記的膀胱癌外泌體；繼續培養24 h 后，棄上清，PBS 清洗細胞3 次；加入4%多聚甲醛固定細胞，靜置20 min，PBS 清洗細胞3 次；加入200 μL 0.1 μg/mL DAPI 染料，靜置5 min，PBS 清洗細胞3 次；室溫避光靜置15 min 后，用共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 表達CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌細胞與PBMC 共培養

使用Ficoll 分離液從健康人的外周血中提取PBMC，按2×105個/孔的密度接種到6 孔板中，同時將表達CD63-EGFP 融合蛋白的5637 細胞按2×105個/孔接種到0.4 μm 孔徑的Transwell 小室中，再把Transwell 小室放入6 孔板中共培養，將未作處理的PBMC 設為對照組，24 h 后用BD FACSCantoTM Ⅱ流式細胞儀檢測PBMC。

2 結果

2.1 pLVX-CD63-EGFP 重組質粒的構建

將CD63 基因插入到pLVX-EGFP-puro，得到pLVX-CD63-EGFP 重組質粒，重組質粒圖譜如圖1A 所示。pLVX-CD63-EGFP 重組質粒經過EcoRⅠ酶和Xho Ⅰ酶酶切后，得到兩個片段，分別與CD63 基因和pLVX-EGFP-puro 質粒的堿基數一致（圖1B）。pLVX-CD63-EGFP 重組質粒基因測序結果與CD63 基因序列完全匹配，無基因突變。

圖1 pLVX-CD63-EGFP 重組質粒的鑒定Fig.1 Identification of pLVX-CD63-EGFP recombinant plasmid

2.2 表達CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌細胞株的構建

通過PEI 將pLVX-CD63-EGFP 重組質粒轉染到293T 細胞中，獲得CD63-EGFP 慢病毒，侵染5637 細胞后，用嘌呤霉素篩選出表達CD63-EGFP融合蛋白的細胞株，在細胞膜上觀察到綠色熒光信號（圖2、3）。

圖2 表達CD63-EGFP 融合蛋白的5637 細胞Fig.2 5637 cells expressing CD63-EGFP fusion protein

2.3 外泌體的鑒定

通過超速離心法提取外泌體，透射電子顯微鏡下觀察到外泌體呈杯口狀（圖3A）。粒徑分析顯示，外泌體直徑40～120 nm（圖3B）。Western blot 結果顯示，外泌體中表達有四跨膜蛋白CD63 和熱休克蛋白HSP70，不表達細胞核中特有的核纖層蛋白Lamin B1（圖3C）。

圖3 EGFP 標記的膀胱癌外泌體的鑒定Fig.3 Identification of EGFP-labeled bladder cancer exosomes

2.4 SV-HUC-1 可在體外攝取膀胱癌外泌體

將EGFP 標記的膀胱癌外泌體加入SV-HUC-1的培養基中，與SV-HUC-1 共培養后，可在SVHUC-1 中觀察到大量綠色熒光信號，分布于細胞質中（圖4）。

圖4 與EGFP 標記的膀胱癌外泌體共培養后的SV-HUC-1Fig.4 SV-HUC-1 cells co-cultured with EGFP-labeled bladder cancer exosomes

2.5 PBMC 中的單核細胞可在體外攝取膀胱癌細胞外泌體

將表達CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌細胞與PBMC 通過Transwell 小室共培養后，可在PBMC 中檢測到15.4%的單核細胞攜帶有綠色熒光信號，而對照組中沒有細胞攜帶有綠色熒光信號（圖5）。

圖5 單核細胞體外攝取膀胱癌細胞外泌體Fig.5 In vitro uptake of exosomes from bladder cancer cells by monocytes

3 討論

外泌體是細胞分泌到細胞外環境的囊泡，通過傳遞生物活性分子介導細胞間的信息交流，在多種生理病理活動中發揮作用，包括免疫反應、腫瘤進展等[14]。但由于外泌體屬于納米級囊泡，未明確外泌體的體內外生物學功能，常需要進行熒光標記示蹤。本研究通過外泌體標志蛋白CD63 與EGFP 的融合蛋白來標記膀胱癌外泌體，避免了使用熒光染料可能出現的假陽性結果，同時使用常規實驗設備即可檢測，為研究膀胱癌外泌體的體內外分布情況奠定了基礎。

腫瘤微環境在癌癥的發生發展和轉移中發揮著重要的作用，而膀胱癌對多種腫瘤微環境相關細胞造成影響，導致膀胱癌的進展。Lin 等[15]證明，膀胱癌細胞通過外泌體將miRNA-21 傳遞給巨噬細胞，使巨噬細胞極化為M2 表型，促進膀胱癌的侵襲遷移能力。Ringuette 等[16]發現，膀胱癌能通過外泌體將轉化生長因子-β 傳遞給成纖維細胞，激活SMAD 通路，使成纖維細胞轉化為癌相關成纖維細胞。本研究通過EGFP 標記的膀胱癌外泌體與SVHUC-1 共培養，發現SV-HUC-1 能在體外攝取膀胱癌外泌體，證明EGFP 標記的外泌體可用于體外示蹤。

另外，Ying 等[17]證明了外泌體可以從Transwell小室的上室到達下室并影響下室細胞的功能。Gao等[18]通過Transwell 共培養系統發現了成熟樹突細胞外泌體可促進內皮的炎癥。因此，本研究使用Transwell 小室將表達CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌細胞與PBMC 共培養，發現PBMC 中的單核細胞可在體外攝取膀胱癌細胞外泌體，證明了用融合蛋白標記外泌體的方法可以省去外泌體的提取過程，直接通過細胞共培養的方式進行外泌體的體外示蹤研究，而且可以通過流式細胞技術對細胞攝取外泌體的情況進行分析，而膀胱癌外泌體對SVHUC-1 和單核細胞的生物學功能的影響尚需進一步研究。