食源性晚期糖基化終末產物檢測技術研究進展

李華韜，張巧智，倪皓潔，王彥波，劉福奇，傅玲琳,*

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江食品質量安全工程研究院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學實驗室與資產管理處，浙江 杭州 310018）

熱加工是食品工業中最為常見的處理手段，以此改善食品的風味、質地并保障產品安全性。在熱加工過程中會發生一系列物理、化學和生物學變化。其中，美拉德反應（非酶糖基化反應）是一類發生在還原糖羰基與蛋白質（多肽/氨基酸）自由氨基間的聚合、縮合反應，常見于各類食品的熱加工和貯藏過程中。美拉德反應進入中期階段后，還原糖與游離氨基經過縮合、重排、裂解及氧化修飾等一系列復雜反應最終生成一類穩定的共價化合物，統稱為晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）。研究發現，食源性AGEs攝入后可在體內蓄積，導致體內AGEs水平的升高，進而危害人體健康。臨床證據表明，高AGEs食物的攝入與糖尿病、慢性腎病、心腦血管疾病和神經退行性疾病等多種疾病的發生密切相關。

食物是人體攝入AGEs的主要來源，因此開展食源性AGEs的檢測分析十分必要。目前，已針對各類AGEs開發出不同的檢測方法，但隨著對AGEs研究的不斷深入，以及食品成分、加工手段和貯存方式的不斷變化，有必要系統梳理各類AGEs檢測手段的特點和應用情況，以便有針對性地開展分析和機理研究。鑒于此，本文結合國內外研究現狀對食源性AGEs的產生與危害、結構與類型以及AGEs的檢測分析技術進行綜述，在此基礎上，深入探討不同檢測技術的特點和優劣勢，以期為后續食源性AGEs的檢測技術發展和研究體系的形成提供參考依據。

1 AGEs的產生與危害

美拉德反應是一種非酶糖基化反應，主要發生在還原糖和帶有游離氨基的分子，如氨基酸、多肽、蛋白質和核酸之間。美拉德反應作為食品加工過程中最常見的化學反應之一，廣泛發生于各類食品的加工和貯藏過程中。通常，美拉德反應可分為3 個階段：初期階段、中期階段和晚期階段。在初期階段，氨基與羰基通過縮合形成Schiff堿，進一步重排產生Amadori產物。在中期階段，Amadori重排產物通過斷裂、環化、Strecker降解等一系列反應生成醛、酮、二羰基和雜環類化合物。在晚期階段，這些化合物進一步發生復雜的反應，包括縮合、脫氫、重排和異構化，最終轉化為類黑素。在美拉德反應進入中期階段后，會形成一系列可與蛋白質/多肽/氨基酸共價結合的異質性穩定化合物，統稱為AGEs。

AGEs根據來源可分為外源性AGEs和內源性AGEs，其中食物是外源性AGEs的主要來源，也稱作膳食AGEs，內源性AGEs是指在人體器官、組織和體液中發生糖基化反應形成的AGEs。膳食AGEs的攝入是機體內AGEs的主要來源，在現代飲食模式下，高溫烹飪和過度食品加工使得食物中常伴有大量AGEs的形成，尤其是加工肉制品、精細加工谷物和高熱量食物（如甜食、煎炸食品、快餐等）。大量研究表明，食品中的AGEs攝入并在體內蓄積后會對人體健康產生危害，這與衰老和多種慢性非傳染性疾病的發生發展有關，如糖尿病、慢性腎病、心腦血管疾病、視網膜病變等。一般認為，AGEs進入體內后可以通過兩種方式產生負面影響：一種是直接與體內的蛋白質發生交聯反應，影響蛋白質的結構和正常生理功能；另一種是通過與多種細胞表面的AGEs特定受體（如AGEs受體（receptor for AGE，RAGE））結合，介導下游細胞信號通路，間接影響細胞的代謝和功能活性。常見的AGEs受體包括可誘導氧化應激和炎癥反應的RAGE、負責清除AGEs的AGE-R1和清道夫受體等。AGEs與受體結合后，可激活多條下游信號通路，影響一系列細胞因子、趨化因子、生長因子和黏附分子的轉錄合成，進而影響細胞趨化、氧化應激、細胞增殖和程序性死亡等多種生理、病理學進程。在正常生理條件下，人體抗糖化防御機制會通過乙二醛酶等酶的作用和細胞內蛋白質的快速更新降解AGEs，減輕其造成的化學損傷。然而，在病理條件下這些防御機制會失效，AGEs開始累積并造成一系列不良后果，最終導致各種疾病的發生。Cai Weijing等分別用高水平和低水平AGEs飼料喂養小鼠，在第3代小鼠中發現，高水平AGEs飼料使小鼠體內AGE-R1水平顯著降低，體質量增加并出現胰島素抵抗，最終誘發糖尿病。Ying Lingwen等對1 471 名2型糖尿病患者進行研究發現，糖尿病視網膜病變與患者體內AGEs水平密切相關，AGEs可作為監測糖尿病視網膜病變進展的重要指標。除糖尿病患者，在對卵巢功能障礙等代謝性疾病患者的研究中也得到類似的結果，即高AGEs飲食與患者體內高水平的雄激素、抗繆勒管激素等具有統計學相關性。此外，氨基酸、肽和蛋白質的糖基化可增加血管壁膠原蛋白交聯程度，這可能是AGEs與心血管疾病及其并發癥密切相關的原因，如Fishman等發現AGEs在激活受體后會通過介導復雜的信號轉導通路，誘發并加重炎癥、氧化應激、增加鈣沉積和血管平滑肌細胞的凋亡，從而促進動脈粥樣硬化的發生。此外，臨床證據還表明AGEs水平是阿爾茨海默癥和帕金森癥等神經退行性疾病的關鍵影響因素，大腦中過量的AGEs蓄積會誘導Tau蛋白磷酸化，加重氧化應激，造成腦細胞氧化損傷。綜上可知，體內AGEs的過量積累可誘發多種慢性疾病，但關于AGEs在體內的生物利用度、代謝以及與生物大分子相互作用的機制尚未闡明，有待進一步研究。

2 AGEs的結構和類型

AGEs結構復雜多樣，目前已被鑒定和表征的AGEs超過40 種，其中在食品中發現的約有15 種。從反應進程上看，AGEs是由還原糖自氧化和初期美拉德產物裂解形成的活性羰基中間體與蛋白質（多肽/氨基酸）自由氨基反應形成。常見的羰基中間體有4 種：乙二醛（glyoxal，GO）、甲基乙二醛（methyglyoxal，MGO）、3-脫氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）和丁二酮。不同的羰基化合物與不同的氨基反應會生成不同物質，最終形成復雜的AGEs產物（圖1）。根據AGEs連接基團是游離氨基酸還是蛋白質/多肽，可將其分為游離態和結合態AGEs；根據所交聯氨基酸（殘基）種類可將其分為賴氨酸衍生AGEs、精氨酸衍生AGEs以及賴氨酸和精氨酸共同衍生的AGEs；而根據所交聯氨基酸個數又可將其分為非交聯型AGEs和交聯型AGEs。

在賴氨酸衍生的AGEs中，GO作為中間體形成的羧甲基賴氨酸（-(carboxyethyl)-lysine，CML）是食品中發現的第一種AGEs，同時也是食品中普遍存在的一種AGEs；與其他AGEs相比，CML具有更高的酸穩定性，其含量與食品中AGEs總含量直接相關，因此可被作為衡量食品中AGEs含量的主要指標。羧乙基賴氨酸（N-(carboxyethyl)-lysine，CEL）是CML的結構類似物，是由MGO與賴氨酸反應形成。此外，吡咯啉是食品中另一種主要的AGEs，屬于吡咯衍生物，其結構含有賴氨酸的N-氨基。除賴氨酸衍生的AGEs外，精氨酸分別與MGO、GO和3-DG反應可生成甲基乙二醛-羥基咪唑酮異構體（methyglyoxal-derived hydroimidazolones，MG-H）1、MG-H2、MG-H3、乙二醛-氫咪唑酮（glyoxal-derived hydroimidazolone，G-H1）和3-脫氧葡萄糖醛酮-二羥基咪唑啉（3-deoxyglucosone-derived dihydroxyimidazoline，3DG-H1）；此外，兩個MGO與精氨酸反應可衍生出精嘧啶。上述AGEs只連接一個氨基酸殘基，均為非交聯型產物，而交聯型AGEs可與多肽鏈內或多肽鏈間的兩個氨基酸基團連接。例如，MGO、GO和3-DG分別與兩個賴氨酸反應可形成甲基乙二醛-賴氨酸二聚體（methylglyoxal-derived lysine dimer，MOLD）、乙二醛-賴氨酸二聚體（glyoxal-derived lysine dimer，GOLD）和3-脫氧葡萄糖醛酮-賴氨酸二聚體（3-deoxyglucosonederived lysine dimer，DOLD），類似反應發生在一個賴氨酸和一個精氨酸殘基之間可形成甲基乙二醛賴氨酸-精氨酸二聚體（imidazolium cross-link derived from methylglyoxal and lysine-arginine，MODIC）、乙二醛賴氨酸-精氨酸二聚體（imidazolium cross-link derived from glyoxal and lysine-arginine，GODIC）和3-脫氧葡萄糖酮賴氨酸-精氨酸二聚體（imidazolium cross-link derived from 3-deoxyglucosone and lysine-arginine，DODIC）。同樣地，戊糖素由戊糖與蛋白質的賴氨酸和精氨酸殘基共同反應產生，其本身具有雜環結構，因而具有自發熒光。值得注意的是，目前兩個精氨酸殘基之間的交聯結構還未被發現，有待進一步研究。由此可見，AGEs種類復雜繁多，各類AGEs由于側鏈結構的不同而具有不同的紫外和熒光光學特性。Poulsen等對各類食品中的AGEs進行系統性綜述。圖2所示為常見的15 種食源性AGEs結構，表1匯總了各類食源性AGEs的光學特性。

圖1 不同活性羰基中間體與各典型AGEs的形成關系Fig. 1 Relationship between different dicarbonyl compounds and down-stream formation of typical AGEs

圖2 常見15 種食源性AGEs的結構示意圖Fig. 2 Structures of 15 common dietary AGEs

表1 常見15 種食源性AGEs的光學特性Table 1 Dietary AGEs and their optical properties

3 食源性AGEs的檢測分析技術

針對食源性AGEs開展檢測分析和危害控制等方面的研究十分必要。食品基質復雜，不同原料成分如蛋白質或糖類等可能通過多種途徑產生AGEs。目前已知的AGEs化合物種類繁多，其結構和存在形式各異，因此需要有針對性地建立合適的分析技術檢測食品中的不同AGEs。

3.1 樣品預處理方法

為準確定量食品中的AGEs，檢測前需先對樣品中的AGEs進行分離和純化。AGEs通常以游離態或與蛋白質/多肽交聯的結合態形式存在。對于游離態AGEs，因其具有較強的極性和優異的水溶性，一般用水或極性溶劑提取即可。如有需要，還需先分離除去樣品中的脂肪，沉淀蛋白質，取上清液進行固相萃取除雜后進行檢測。Nomi等在檢測醬油和啤酒中的游離AGEs時，使用磺基水楊酸水溶液作為提取溶劑，將樣品離心沉淀后除去蛋白質，取上清液通過C固相萃取柱純化后進行色譜定量分析。Scheijen等分別使用三氟乙酸和氯仿-甲醇（2∶1，/）進行脫脂，通過比較在牛乳、白面包和番茄醬基質中的回收率，發現采用后者的脫脂效果更佳。除此之外，正己烷、丙酮和三氯乙酸等也可用作預處理中脂肪的萃取溶劑。

為全面準確定量AGEs，不僅需要檢測游離態AGEs，還需提取結合態AGEs，因此需要將蛋白質徹底水解成短鏈肽或游離氨基酸，以釋放其中的結合態AGEs。常用的水解方法有酸水解法和酶解法兩種。酸水解法一般使用鹽酸，在酸水解前，需向樣品中加入還原劑硼氫化鈉（NaBH）以防止水解過程中早期美拉德反應產物果糖賴氨酸氧化生成CML造成結果誤判，然后用6 mol/L HCl溶液在110 ℃下水解20～24 h。該方法適用于對酸穩定的AGEs（如CML、CEL），但不適用于酸性條件下不穩定的AGEs（如吡咯啉）。酶解法常用的酶有胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶E、脯氨酸肽酶和氨基肽酶等，實際操作時往往會將特異性不同的蛋白酶組合以保證蛋白質徹底水解。Zhu Rugang等采用胃蛋白酶等多種蛋白酶水解嬰兒配方乳粉，分析并測定AGEs（游離態和結合態）總含量。Jost等在檢測面包中AGEs時將每個樣品同時經酸水解和酶水解處理，比較后發現，對于酸穩定的AGEs，酸水解法的效率高于酶解法。

3.2 酶聯免疫吸附測定法

酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作為一種常見的免疫分析方法，其原理是基于抗原-抗體特異性結合和酶促底物反應產生的吸光度變化定量樣品中的目標物。以競爭ELISA法檢測AGEs時，首先將抗原包被在微孔板上，加入食物樣品和酶標抗體，待抗原-抗體反應發生后，添加酶反應底物，底物被酶催化發生顏色變化，利用酶標儀檢測吸光度，通過AGEs含量與吸光度關系得到定量結果。由于酶催化效率很高，免疫反應結果被間接放大，因此ELISA具有很好的靈敏度和特異性。1999年Tauer等首次報道了一種無需對樣品凈化處理即可直接檢測加熱乳制品中CML含量的競爭ELISA法，但該方法使用的抗體特異性表位表征不充分，容易造成假陽性結果，且無法檢測不溶性組分中的CML。對此方法進行改進后，Goldberg等將食品樣品均質化并溶解在磷酸鹽緩沖液中，使用充分表征的抗CML單克隆抗體，通過競爭ELISA法測定250 種常見食品中的CML含量，初步構建了膳食AGEs數據庫。在此基礎上，Uribarri等將食品種類增加到549 種，同時使用抗CML和抗MGO單克隆抗體，進一步豐富了膳食AGEs數據庫，證明了食品原料中宏量營養素的組成和加工方式是影響AGEs形成的關鍵因素。值得指出的是，ELISA法容易受到樣品預處理方法、食品基質以及抗體與非靶向表位交叉反應的影響，導致檢測結果發生偏差。例如，Tareke等發現酸水解預處理會使ELISA法檢測燕麥粥樣品中的CML含量偏低。此外，有研究發現，因抗體在親脂性基質中的溶解性較低，富含脂肪的食品基質會導致AGEs含量測定結果偏高，富含淀粉的基質則會導致AGEs含量測定結果偏低。

3.3 儀器分析法

3.3.1 熒光光譜

各類AGEs由于化學結構不同而具有不同的光學特性。一般含有氧雜萘鄰酮、喹喔啉酮和苯并噁嗪酮結構的AGEs具有熒光特性（如精嘧啶、戊糖素等（表1）），因此可以通過熒光光譜法檢測這類AGEs的含量。房紅娟等利用熒光光譜法檢測當地19 種日常消費食品中的AGEs含量，采用激發波長370 nm、發射波長440 nm，結果表明高蛋白和高脂肪食品（如肉類、餅干、巧克力等）相較于高水分和高碳水化合物食品（如蘋果、可樂、方便面等）的熒光AGEs含量更高。Chhabra等使用熒光光譜法，在激發波長355 nm、發射波長440 nm下檢測食用油中的熒光AGEs含量。AGEs熒光光譜的激發波長一般在300～420 mm，發射波長在350～600 mm。Wu Runlin等將儀器參數設置為激發波長345 nm、發射波長350～550 nm，對油炸魚塊中的熒光AGEs進行檢測，發現隨油炸時間延長魚塊表面形成的AGEs含量增加，表明加工條件對AGEs含量影響顯著。熒光光譜法操作簡單但缺乏特異性，使用熒光強度間接反映AGEs含量，檢測結果容易受到其他熒光物質的干擾。

3.3.2 高效液相色譜

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是一種高靈敏度的色譜檢測技術，所用檢測器有二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）、熒光檢測器（fluorescence detection，FLD）等。Poojary等將牛乳樣品經酶水解處理后，采用HPLC-DAD檢測其中吡咯啉含量。然而此方法僅適用于具有紫外光吸收特性的AGEs（如吡咯啉、GOLD、MOLD等）。對于具有熒光特性的AGEs，可使用HPLCFLD進行檢測。但對于非熒光AGEs（如CML），則需先通過衍生化得到具有熒光特性的AGEs衍生物，然后在反相柱中分離，最后使用FLD分析相應AGEs衍生物。Chen Gengjun等以鄰苯二甲醛為衍生劑，分別與雞、豬、牛和魚肉的水解產物混合反應5 min，然后采用HPLC-FLD進行檢測，根據衍生物峰面積確定不同樣品中的CML含量。樣品在酸水解和衍生化等復雜預處理后容易引入雜質造成干擾，為考察方法的準確度，Kul等利用HPLC-FLD檢測熟肉制品中的CML含量，通過添加CML標準品和同位素內標物驗證該方法的回收率為95.92%～105.16%，具有良好的準確度。總體上，HPLC檢測方法穩定、可靠，但由于許多常見的AGEs不具有紫外或熒光光學特性，需要衍生化處理，因此其應用范圍受到限制。

3.3.3 氣相色譜-質譜聯用技術

由于樣品在氣相中流動速率較快，樣品組分經過色譜柱后可被迅速分離，因此氣相色譜（gas chromatography，GC）分析效率較高。經GC分離后的氣體化合物聯合質譜（mass spectrometer，MS）鑒定可對目標物進行定量分析。GC-MS已被用于測定不同食品中CML含量，如油炸魚餅、烤蕎麥等。衍生化是GC-MS分析前的關鍵步驟，對檢測結果的準確性影響顯著，Prestel等在檢測牛乳中CML含量時，對衍生化試劑、溶劑、溫度和時間進行優化，最終選擇乙腈為溶劑，將樣品在80 ℃下甲硅烷基化45 min，然后采用GC-MS進行分析，得到最佳衍生物峰，計算結果具有更高準確度。GC-MS具有高效率、高分辨和高靈敏度等優點，但是在分析前需通過三氟甲基酯等試劑對AGEs進行衍生化，預處理過程復雜且回收率低，因此GC-MS不適用于大批量食品中AGEs的檢測分析。

3.3.4 液相色譜-串聯質譜技術

近年來，越來越多的研究人員將液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）應用于食源性AGEs的檢測。LC-MS/MS將LC對復雜樣品組分的高分離能力與MS/MS的高靈敏度、高選擇性和高準確度相結合，可高效準確地檢測食品中的AGEs。常見的MS技術包括離子阱質譜（ion trap mass spectrometer，ITMS）、三重四極桿質譜（triple quadrupole mass spectrometer，QqQ-MS）和四極桿飛行時間質譜（quadrupole time-of-flight mass spectrometry，Q-TOF-MS）等。ITMS和QqQ-MS結構不同但原理類似，均通過選擇母離子和子離子將特異性子離子的強度信號轉化為色譜峰面積進行定量；而Q-TOF-MS則根據不同質荷比離子穿過飛行管的速率不同達到分離效果，將飛行時間轉化為信號強度進行定量。在定量分析物時，MS/MS常采用多反應監測模式，即在樣品離子化后選擇特異性母離子，通過碰撞將其分裂成子離子，然后僅選擇特異性子離子采集MS信號，最后通過統計分析獲得定量結果。Gomez-Ojeda等采用不同烹飪方式處理馬鈴薯、肉類和魚類，采用傳統ELISA法無法檢測出其中CML含量的變化，但是利用LC-ITMS/MS可以測出樣品CML含量的微小差異，表明方法靈敏度較高，但該方法相對標準偏差為1.20%～16.40%，精密度有待提高，這是由于ITMS存在空間電荷效應，樣品中雜質越多效應越強，因此對于復雜食品基質，QqQ-MS是更優的選擇。基于此，Yu Jingjing等使用HPLC-QqQ-MS/MS建立煙草產品中CML和CEL的定量分析方法，該方法的檢出限分別為0.36 ng/mL和0.25 ng/mL，日內和日間精密度分別低于6.3%和9.7%，加標回收率為88.7%～120.0%。

上述研究工作的色譜分離均采用C色譜柱。由于AGEs為高極性化合物，在C色譜柱中的保留效果和分離度均不理想，通常需要添加離子對試劑（如全氟戊酸）提高其保留性，但離子對試劑對色譜柱和儀器會造成一定損害。鑒于此，楊明等建立煎炸植物油中CML和CEL含量的HPLC-MS/MS檢測方法，比較C、HILIC和氨基酸3 種色譜柱的分離效果，發現氨基酸色譜柱不僅對AGEs有較好的保留效果，而且實現了有效分離。此外，該方法還優化了流動相體系、MS條件等，提高了檢測結果的準確性和可靠性。HPLC-MS/MS雖然準確可靠，但在面對日常食品的大批量檢測時，需要更加快捷高效的檢測方法。

為實現大批量樣品中AGEs的高效定量分析，超高效液相色譜-質譜聯用（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術受到研究者們的關注。相較HPLC，UPLC系統可承受103～124 MPa高壓，可在更寬的液體流量范圍內工作，在很大程度縮短分析周期的同時確保有良好的分離效果，是一種靈敏度和效率更高的檢測技術。Hull等根據西方飲食模式選擇了257 種食物，采用UPLC-MS/MS法檢測各類食品中的CML含量，并結合膳食調查評估人均CML攝入水平，為消費者減少膳食CML的攝入提供了重要參考。在此基礎上，Scheijen等對方法學進行調整，實現了一次性分析食品中CML、CEL和MG-H1這3 種主要AGEs的含量，然后對190 種食品中3 種AGEs進行定量分析，進一步豐富了膳食AGEs數據庫，為設計低AGEs和高AGEs飲食干預研究奠定了基礎。上述研究結果表明UPLC-MS/MS可用于谷物、肉類、蔬菜和乳制品等10余種加工食品類別，具有廣泛且良好的適用性。除此之外，該方法也可用于研究烹飪方式對食品中AGEs的影響。朱玉潔采用UPLC-MS/MS方法并優化樣品預處理條件（加入還原劑并用固相萃取柱除雜），發現煎炸食品中CML和CEL的生成量與煎炸溫度和時間存在顯著相關性。隨著食品工業的發展，越來越多的新型加工方式相繼出現，針對不同烹飪方式影響膳食AGEs形成還有待深入研究。

與其他色譜方法相比，UPLC-MS/MS檢測食品中AGEs的優勢突出，但仍存在不足，在檢測一些復雜基質樣品時會受到基質效應的干擾導致誤差。因此，基于同位素稀釋法的UPLC-MS/MS成為目前檢測食品中AGEs的最佳方法。通過在樣品中定量添加穩定同位素內標，使其與樣品充分混合，通過MS法測定同位素豐度比，再依據同位素稀釋原理定量待測物質含量。該技術可有效避免樣品基質中其他因素的干擾，具有絕對定量性質，且靈敏度、分析精度高（圖3）。Poojary等建立一種基于同位素稀釋法的UPLC-MS/MS方法，用于同時定量加工食品和生物樣品中的各類AGEs化合物。該方法采用反相C色譜柱分離，添加9 種穩定同位素標記的內標，使用Orbitrap對15 種AGEs及其他美拉德反應產物共20 種分析物進行定量，并在超高溫瞬時滅菌乳、烤雞胸肉、烤雞皮和牛血漿等6 種基質中驗證方法的準確性，結果表明，該方法具有良好的線性、準確度、精密度和重現性，為全面分析食品和生物基質中多種AGEs提供了重要手段。此外，該團隊通過此方法探究綠茶提取物對牛乳貯藏過程中14 種AGEs含量的影響，揭示了多酚對AGEs衍生過程的影響，這為利用天然化合物抑制食品中美拉德反應和AGEs形成的機制研究提供了新思路。Cheng Weiwei等建立了基于穩定同位素稀釋的UPLCQqQ-MS/MS方法，用于同時檢測烘焙和油炸食品中CML、CEL和丙烯酰胺的含量，通過計算基質效應參數，進一步驗證了該方法的準確性和適用性。該研究創新性地將AGEs與丙烯酰胺進行同步測定，有助于更準確地評估食品安全性。此外，利用該方法高靈敏度等特點，徐正華等對來自不同國家三文魚中的AGEs含量進行檢測，發現CEL含量可作為挪威三文魚的產地特征因子用于區別智利和法羅群島三文魚，其檢出限為0.032 7 ng/g，該研究成果為食品產地信息溯源以及真偽鑒別提供了新思路。

圖3 基于同位素稀釋法的LC-MS/MS原理示意圖Fig. 3 Schematic illustration of the principle of isotope dilution LC-MS/MS

表2匯總了若干儀器分析方法測定不同食品中AGEs含量的結果。

表2 儀器分析方法測定不同食品中AGEs含量的結果Table 2 Instrumental determination of AGEs in different foods

續表2

3.3.5 生物傳感器技術

近年來，基于分子印跡的生物傳感器技術作為一種低成本、簡單快速的檢測方法，已被應用于檢測食品中特定AGEs的含量。通過分子印跡技術制備的分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）對模板分子具有特異性識別能力，可以實現高選擇性的精確定量檢測。Liu Huilin等通過反相微乳液法以CML為模板分子制備基于半導體納米材料-疏水性量子點的新型MIP，開發基于此MIP的熒光傳感器用于測定面包、巴氏殺菌乳和嬰幼兒配方乳粉中的CML含量，通過HPLC-MS進一步驗證該方法的準確性和重現性。結果表明，該熒光傳感器易于制備且成本較低、特異性和靈敏度高，待測樣品預處理步驟簡單，這為方便、快速、準確定量食品中的AGEs提供了新技術方案。相較于其他方法，上述生物傳感器檢出限較高，不建議檢測食品中痕量AGEs。

4 食源性AGEs檢測技術應用優勢比較

目前可用于食源性AGEs的檢測方法很多。ELISA法靈敏度高、檢測速率快，適用于大量樣品檢測，但是需要選擇特定抗體，目前市場中商業化抗體均為針對檢測CML制備，暫無針對其他類型AGEs的特異性抗體可供使用。此外，利用ELISA定量的結果均以KU/100 g（以食品質量計）表示，并非樣品中AGEs的絕對含量，而使用LC-MS/MS等儀器分析的結果一般表示為mg/kg（以蛋白或食品質量計），兩種方法對結果的表達方式不同，數據間難以分析比較。同時，有研究指出ELISA檢測結果往往無法通過儀器分析方法重現，這可能是因為美拉德反應產物復雜多樣，樣品基質中存在交叉反應物質，而ELISA易受到這些雜質干擾導致假陽性/假陰性的出現。因此，對于免疫分析方法，有必要針對特異性抗體的靶向表位、交叉反應性、基質效應和前處理方法等方面進行改良和優化，以提升這類方法在檢測食品中AGEs時的適用性和準確性。

在儀器分析方法中，熒光光譜法雖然成本較低、靈敏度和選擇性好，但僅能分析具有自發熒光特性的AGEs，不能分析非熒光類AGEs。此外，熒光光譜對檢測樣品試劑要求嚴格，檢測時需注意避免被外界環境因素污染熒光影響準確度，這一定程度限制了該方法的應用。目前，色譜類技術因其出色的靈敏度、準確性和精密度受到研究人員青睞。HPLC-DAD或HPLC-FLD可以對具有特定紫外吸收或熒光特性的AGEs進行定量分析；其他AGEs則需經過衍生化，使其具備特有的光學特性才能被定量檢測。在使用GC-MS時，測試樣品同樣需要繁瑣的柱前衍生化處理，而衍生化試劑等的選擇不當會導致衍生化不完全、衍生物不穩定等，影響檢測結果。

LC-MS/MS技術具有適應性廣、分離和定性定量能力強等優勢，在AGEs檢測領域的應用備受關注。與HPLC-MS/MS相比，UPLC-MS/MS具有更好的選擇性、靈敏度、精密度和回收率，而且分析周期大大縮短，這極大提高了分析效率。但是上述方法的樣品預處理過程均較復雜，在檢測時也易受到不同食品基質的干擾和影響。基于同位素稀釋法的UPLC-MS/MS法可以有效規避基質效應和其他樣品處理過程帶來的誤差，提高檢測準確性，因此被認為是同步準確定量食品中多種AGEs的最佳手段。但是，這類大型儀器分析設備成本高、價格昂貴、耗時長，且對操作人員要求高，這在一定程度限制了其推廣應用。因此，有必要開發方便快速、低成本、高靈敏度的AGEs檢測技術。例如，基于MIP的熒光傳感器成本低且易于制備，是近年來新興的AGEs檢測方法之一，這類方法具有良好的發展前景，或將成為未來AGEs檢測技術的發展方向。

不同AGEs檢測方法的優缺點如表3所示。

表3 不同AGEs檢測技術的優缺點比較Table 3 Comparison of different techniques for detecting AGEs

5 結 語

食品加工過程中美拉德反應賦予了食品獨特的風味、顏色和質地，但這一過程往往伴隨著大量AGEs的形成。消費者攝入過量食源性AGEs會對機體健康構成潛在危害，因此檢測加工食品中AGEs含量對保證食品品質和人體健康方面至關重要。隨著研究的深入，各類檢測方法的準確度和靈敏度逐步得到提升，與免疫分析方法相比，儀器分析方法尤其是LC-MS聯用技術具有更好的選擇性、回收率、重復性和準確性等。然而，現有研究大多局限于少數幾種代表性AGEs，如CML、CEL等，如何全面快速檢測食品中各類AGEs含量，探究不同食源性AGEs的形成機理和分布特征仍是該領域面臨的挑戰。此外，簡化樣品預處理方法，優化針對不同基質的預處理手段，提升AGEs檢測效率，也是當前亟需解決的問題。本文針對各種檢測方法進行討論并對優缺點和發展方向進行總結，可為進一步改進現有檢測手段或開發新的AGEs檢測技術提供參考和借鑒。