基于表面增強拉曼光譜標記技術的生物傳感器用于農藥殘留檢測的研究進展

顏朦朦，李慧冬，張文君，陳子雷，郭長英，朱 超,*，佘永新

（1.山東省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，山東 濟南 250100；2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081）

天然或合成農藥主要用于預防、消除或控制作物疾病、害蟲和雜草等。然而，只有不足1%的農藥真正發揮了作用，剩余部分進入環境，并在食物鏈中大量累積和持久殘留，進而對人體健康造成影響，如致癌性、遺傳毒性和免疫毒性等。因此，農藥的監管、監測非常重要。

自20世紀70年代以來，質譜法和色譜法（又稱確證方法）被視為農藥殘留檢測的金標準，具有檢測靈敏度高、準確性好、精密度高的優點，然而，這些方法所需設備價格昂貴、檢測費用高、需專業人員操作，僅適用于實驗室檢測，不能滿足現場檢測、進出口口岸及超標事件應急處理的迫切要求。近年來，對農藥殘留快檢方法的研究得到越來越多的關注，如電化學生物傳感器、光學生物傳感器（熒光、量子點、表面等離子體共振等）、表面增強拉曼光譜（surface enhancement Raman spectroscopy，SERS）技術、聚合酶鏈式反應法、酶聯免疫吸附測定法等，這些方法具有儀器可小型化、可用于現場檢測、檢測成本低、準確性高、檢測速度快等優點，是確證方法的有效補充。

其中，SERS技術因具有檢測速度快、特異性強（可提供目標物指紋信息）、靈敏度高、可實現多殘留檢測等特點，已被廣泛應用于食品安全、環境監測、生物醫學等領域。SERS技術是一種超靈敏振動光譜技術，用于檢測貴金屬（金（Au）或銀（Ag））納米結構（通常稱為增強基底）表面或表面附近的分子，可將分子原有但微弱的拉曼信號增強至幾個數量級（通常為10～10），甚至可達到單分子檢測水平，另外，便攜式拉曼儀的快速發展更加滿足了快檢的需求。

現階段，SERS應用于農藥殘留檢測主要有兩種模式：直接檢測（無標記）和間接檢測（有標記）。直接檢測，是增強基底對農藥分子直接產生增強作用，利用信息豐富的指紋圖譜，達到定性定量的目的，具備分析速度快、特異性強等優點。直接檢測技術在農藥殘留快速檢測方面取得了一定研究成果，但現已報道的方法中，仍存在較多問題：其檢測靈敏度低，不能滿足國家規定的最大殘留限量標準；SERS對具有類似結構性質和拉曼活性的同系物選擇性較差，難以實現農藥多殘留同步分析；農產品基質的SERS信號易與農藥分子的SERS圖譜重合，基質效應嚴重；且一些農藥因結構問題難以通過直接檢測將其識別。因此，僅依靠開發新型高增強因子（enhancement factor，EF）的增強基底已不能滿足所有農藥檢測的需求。研究和開發新的SERS檢測方法將是一個新的突破點。

SERS間接檢測技術又稱SERS標記技術，其原理是將貴金屬納米粒子與強拉曼散射分子（拉曼報告分子（Raman reporters，RRs））組成SERS標簽，其簡易制備過程如圖1所示，此類SERS標簽具有類似于熒光團的光學標記功能，具有較高靈敏度、較好的分子指紋保真度、強抗光漂白性、圖譜范圍窄（比熒光窄1/10～1/100）、可多路復用等性能，已成為化學和生物醫學檢測的優良標記物。SERS標簽可以進一步結合識別分子（如抗體、適配體、分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIPs）等），組成基于SERS標記技術的生物傳感器，在目標物不具有SERS信號的情況下，對目標物進行定性定量檢測。目前SERS標記技術已用于多種危害因子檢測，實現了納米技術、生物分析技術、生物傳感的有機結合。近年來，這項技術也逐漸應用到農藥殘留領域，有效解決了SERS技術用于農藥殘留檢測的部分難題，并取得了突破性成果。然而，目前鮮見綜述對基于SERS標記技術的生物傳感器在農藥殘留檢測領域的應用研究進展進行全面地總結。因此對其進行概括總結對于將基于SERS標記技術的生物傳感器更廣泛地應用于農藥殘留檢測，甚至食品安全檢測領域具有重要意義。

圖1 SERS標簽的制備Fig. 1 Preparation of SERS tags

本綜述系統總結近年來SERS標記技術應用于農藥殘留檢測的研究進展，首先介紹SERS標簽的設計及制備方法；然后根據不同的識別元件（抗體、適配體、MIPs等），介紹SERS標記技術在農藥殘留檢測方面的應用情況；最后總結SERS標記技術在農藥殘留檢測方面的未來發展前景及挑戰。

1 SERS標簽的設計及制備

1.1 SERS增強基底

在SERS標記方法中，SERS標簽對于傳感器的檢測性能起著至關重要的作用。典型的SERS標簽由兩個重要部分組成：金屬納米顆粒（SERS增強基底）和RRs。其中，SERS增強基底用于增強RRs的拉曼信號。金納米顆粒（Au nanoparticles，Au NPs）或銀納米顆粒（Ag nanoparticles，Ag NPs）是最常用的SERS增強基底，可對報告分子的拉曼信號進行顯著增強。Au NPs因制備簡單，是最常用的增強基底。納米粒子的形狀影響其光學特性，尤其是納米粒子的邊緣和尖角，可實現最高的近場增強，進而提高靈敏度。目前，已報道多種不同類型SERS增強基底，包括納米棒（nanorods，NRs）、金納米二聚體（Au nanodimers，Au-NDs）、納米星、納米棱鏡和納米球、納米三角形等。Au NRs是SERS增強基底的最佳備選材料之一，其邊緣有很強的SERS增強作用。納米星和納米花也是很好的備選材料，因為它們具有更大的比表面積，能夠使更多的RRs附著在其表面上。另外，納米星尖端的相互影響也可以進一步增強SERS信號。此外，因為雙金屬NPs之間的等離子體耦合可產生巨大的電磁增強，核心-殼型金屬納米顆粒也被廣泛用于制備SERS標簽，如Au@Ag NPs、Au NRs@Ag、Au@Au-Ag NPs、Au@Pd@Pt NRs等。改善SERS增強的另一個重要方法是通過促進納米粒子的聚集來創建更多的“熱點”。這些增強基底都可以應用于SERS標簽的設計，并應用到農藥殘留檢測中。

1.2 拉曼報告分子

RRs是SERS標簽的信號源。常用的RRs通常包含巰基（-SH）或氨基（-NH）基團，例如孔雀石綠異硫氰酸酯（malachite green isothiocyanate，MGITC）、5,5-二硫代-2-硝基苯甲酸（5,5-dithio-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、4-氨基苯硫酚（4-aminophenylthiophenol，4-ATP）、4-巰基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，4-MBA）、4-巰基吡啶（4-mercaptopyridine，4-MPY）、羅丹明6G（rhodamine 6G，R6G）、4,4’-聯吡啶、2,2’-聯吡啶、4-氨基苯硫醇（4-aminobenzenethiol，4-ABT）、3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid）、4-甲基卞硫醇（4-methoxybenzyl mercaptan，4-MATT）、4-硝基硫酚（4-nitrothiophenol，4-NTP）等，這些RRs有如下共同特點：1）這些分子可以很容易且牢固地附著在金屬納米粒子表面；2）這些分子的散射截面高從而能夠獲得強拉曼信號。但現階段常用的RRs的SERS圖譜出現在600～1 800 cm范圍內，常與基質的SERS圖譜重合，抗基質效應性能差。近年來，一些具有炔烴、氰、疊氮化物等外源基團的化合物被應用于構建SERS標簽，這些新型標簽在1 800～2 800 cm的細胞拉曼沉默區表現出明顯的拉曼散射峰，可避免與生物基質的SERS圖譜重合，進而避免背景信號干擾。且已成功應用于農藥殘留檢測。總之，SERS標簽設計的宗旨是保證高的靈敏度及化學和物理穩定性。

2 SERS標記技術應用于農藥殘留檢測

本部分從檢測原理、檢測效果等方面系統歸納近年來基于不同識別分子（抗體、適配體和MIPs）的SERS標記技術用于農藥殘留的檢測方法。不同識別分子的SERS標記生物傳感器如表1所示。

表1 基于不同識別分子的SERS標記生物傳感器應用于農藥殘留檢測Table 1 SERS label-based biosensors with different recognition elements for pesticide residue detection

2.1 基于SERS標記技術的免疫傳感器

抗原-抗體免疫反應是生物傳感器最常用的識別機制，可提高SERS技術的選擇性和敏感性。抗體是一種大分子質量Y形蛋白，也稱為免疫球蛋白，它是通過在動物體內免疫產生的，可對各種分析物（抗原）靶向特異性識別。農藥分子一般是小分子，其免疫原性差，通常需要通過分子結構的設計和改造與蛋白質分子結合，再進行動物免疫，進而得到活性強的抗體。一般來講，抗體對農藥分子只有一個識別位點，需要通過競爭法進行農藥殘留的檢測。在此免疫反應中主要包括3 個部分：SERS標簽、競爭免疫基底和識別探針。基于以上機理，Li Xiaozhou等提出了一種基于SERS的免疫層析（immunochromatographic assay，ICA）方法，用于氯氰菊酯和高氰戊菊酯農藥的雙重檢測，如圖2A所示，該學者以Au NPs為增強基底，以4-MBA、4-ATP為RRs，制備了SERS標簽，然后再通過共價鍵作用，將抗體修飾在SERS標簽的表面，形成識別探針；并將農藥分子與雞卵清白蛋白的復合物固定在試紙條上，形成競爭基底物。不同的是，該試紙條具有兩條檢測線，由于兩個RRs的特征峰出現在不同位置，可用同一波長激光激發，進而進行多殘留檢測。此方法對氯氰菊酯和氰戊菊酯兩種農藥殘留的檢測限分別為2.3×10ng/mL和2.6×10ng/mL，其靈敏度比酶聯免疫吸附試驗法和熒光ICA法高3～4 倍，且對于自來水、河水等實際樣品中兩種農藥殘留的檢測具有良好的回收率。為了避免基質效應，Sun Yue等進行了以4-巰基苯甲腈（4-mercaptobenzonitrile，4-MBN）為RRs的SERS標記免疫實驗，4-MBN的SERS特征峰出現在1 800～2 800 cm處，可以有效避開出現在低于1 800 cm處農產品基質的拉曼特征峰；該學者另以Au NRs@Ag為增強基底，制備SERS標簽，在標簽的表面修飾農藥抗原分子，作為競爭基底物，在磁性納米粒子的表面修飾抗體，用以識別農藥分子，通過競爭反應，成功應用于河水和蘋果汁中吡蟲啉的檢測，回收率在96.8%～100.5%之間（圖2B）。

抗體用于農藥分子識別時也存在一些問題，如農藥小分子結構改造難度大，不易得到免疫原性高的抗原，進而難以得到有效抗體；另外抗體制備、純化過程非常復雜，生產成本高；制備出的抗體貯藏穩定性受溫度、pH值、有機溶劑等條件影響大。因此，尋求其他特異性強的識別元件顯得尤為重要。納米抗體的研究可有效解決部分問題，若與SERS標記技術相結合，應能推進免疫傳感器的進一步發展。

2.2 基于SERS標記技術的適配體傳感器

圖2 基于SERS標記技術的免疫傳感器Fig. 2 SERS label-based immunosensors

適配體經體外篩選得到，是長度一般在20～80 個核苷酸之間的單鏈寡核苷酸或者短的多肽。適配體和靶標農藥通過氫鍵、范德華力、疏水作用等作用力進行特異性識別與結合。在靶標農藥存在的情況下，適配體與靶分子相互作用，將自身折疊成各種三維結構，包括G-四聯體、發夾結構和T-結構等。與抗體相比，適配體作為識別元件有以下幾個優點：1）適配體的合成是在體外進行的，不需要動物實驗；2）由于小分子的低免疫原性，抗體通常需要在免疫前與載體蛋白結合以獲得有效抗體。而對于小分子的適配體可以從體外直接分離得到；3）由于分離適配體通常只需幾周時間，因此它可以很大程度上節省時間；4）與基于抗體的免疫分析方法相比，通過使用各種基于核酸的信號放大技術，可以進一步提高生物傳感器的檢測靈敏度；5）適配體還具有其他一些優異的特性，如所能適應的溫度和pH值范圍較寬、易于化學合成、批次間的差異性較小、易于修飾標記分子等。適配體在生物傳感器的應用有效增加了識別元件的種類。Sun Yue 等以適配體為識別元件，以Au NPs為增強基底，以4-(巰基甲基)苯甲腈（4-(mercaptomethyl) benzonitrile，MMBN）為RRs，制備了MMBN-Au NPs-適配體識別探針，然后在Ag NPs修飾的硅片上固定適配體識別鏈用作競爭基底物，通過競爭法實現了啶蟲脒的靈敏檢測，檢測限達到6.8 nmol/L，并成功應用到蘋果汁中啶蟲脒的檢測，其檢測原理如圖3A所示。Wei Xiao’ou等同樣使用MMBN為RRs，以Ag NPs為SERS增強基底，制備MMBN-Au NPs-適配體識別探針，然后在FeO@Au核殼納米粒子上修飾適配體識別鏈用作競爭基底物，完成了櫻桃番茄和葡萄中阿特拉津的靈敏檢測，回收率在98.7%～106.6%之間（圖3B）。Lu Yuxiao等利用DNA可以形成四面體結構的優勢，構建了多殘留SERS-適配體生物傳感器，如圖3C所示，四面體骨架的4 個角是由1 個Ag@Au NPs納米粒子及3 個修飾有不同RRs（4-ATP、4-NTP和4-MATT）的Ag@Au NPs納米粒子組成，其檢測原理如下：首先將3 種農藥的適配體嵌入到DNA四面體骨架中的3 個邊緣，當適配體識別農藥分子時，隨著適配體結構變化，DNA四面體也隨著變化，Ag@Au NPs納米粒子就會相互接近，形成SERS熱點，進而測得不同RRs的拉曼信號，實現農藥分子的檢測，最終最低可檢測到0.002 1 ng/mL的丙溴磷、0.004 6 ng/mL的啶蟲脒以及0.006 1 ng/mL的多菌靈；通過實際樣品的添加回收試驗可知，該法與高效液相色譜-質譜法具有較好的一致性。

適配體在農藥分子檢測中的應用受到越來越多的關注，但是農藥分子的適配體種類還是相對較少，急需篩選得到更多的適配體以供實際應用，另外在基質中適配體與靶標分子的結合性能還需要進一步優化。

2.3 基于SERS標記技術的仿生免疫傳感器

圖3 基于SERS標記技術的適體傳感器Fig. 3 SERS label-based aptasensors

MIPs仿生識別元件，屬于超分子研究領域，其制備過程如下：首先印跡分子（靶標或靶標分子類似物）與功能單體之間通過非共價鍵和/或共價鍵結合，形成主客體配合物；然后再加入交聯劑及引發劑，通過聚合反應，形成高分子聚合物；最后通過適當的方法將印跡分子洗脫或解離，形成具有識別印跡分子及靶標分子結合空腔的聚合物。

MIPs因具有特異性高、易制備、成本低、化學及物理穩定性好的優點而常被用作前處理材料。與SERS技術結合時，通常將MIPs修飾在SERS增強基底的表面用于識別農藥分子，起到聚集農藥分子的作用，進而對農藥分子進行SERS直接檢測，而與SERS標記技術結合的研究較少。2019年，Yan Mengmeng等創建了仿生納米酶酶聯免疫吸附實驗（biomimetic nanozyme-linked immunosorbent assay，BNLISA）用于三唑磷SERS與比色雙模式檢測，首先合成三唑磷均勻MIPs微球，通過離子液體均勻的固定在96 孔陣列板上，形成識別元件。然后在三唑磷抗原分子上標記納米酶，納米酶可以催化四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）為氧化TMB（TMB），TMB與SERS增強基底反應后會產生很強的SERS信號，而且，其顏色變化可用肉眼觀察到。此方法屬于SERS間接標記技術，可用SERS及比色雙模式檢測方法測定梨中三唑磷農藥殘留，其檢測原理如圖4所示。

MIPs作為仿生識別分子已應用多種有害因子的檢測，但仍存一些問題，如識別特異性有所欠缺，有些MIPs只能用于有機相識別目標分子，另外，對農藥分子的MIPs與SERS標記技術相結合的研究仍較少。

圖4 BNLISA用于三唑磷SERS與比色雙模式檢測[54]Fig. 4 BNLISA for colorimetric and SERS sensing of triazophos[54]

3 結 語

本綜述總結了近年來SERS標記技術在農藥殘留檢測領域的應用情況，SERS標記技術具有成本低、靈敏度高、多路復用性能好的特點，但是這些研究仍僅適用于實驗室，如將其工業化應用，仍需要做出更多的努力。在此提出以下建議：1）為了保證SERS信號的靈敏度、穩定性和再現性，應重點制備具有重復性好、穩定性強和均勻性高的SERS標簽。其中，使用RRs內標校正SERS信號的波動是實現可靠定量SERS分析的有效方法。另外，SERS增強基底的穩定性、均一性非常重要，近期，利用3D技術制備貴金屬納米粒子以改善粒子的均一性受到研究者的青睞。二維材料具有獨特的光學特性和較大的比表面積（可克服傳統貴金屬納米材料的缺點）也開始被應用于SERS增強基底。2）食品基質非常復雜，很容易干擾SERS標簽的SERS信號，因此避免基質效應是保證方法準確性的重要措施。為解決這一問題，有些研究人員在SERS標簽的表面修飾一層保護層，如二氧化硅、二氧化鈦、脂質體等，其中二氧化硅因具有化學惰性、機械穩定性、表面易修飾等特點而成為最常用的保護層。核-殼型納米粒子也受到研究者的青睞，一般由兩種貴金屬組成，RRs存在于兩種貴金屬之間的縫隙中，其信號不僅可被增強，而且不易受外界環境的影響，但是外層的貴金屬層仍會增強非靶標物質信號，受基質影響較大。另外，一些具有炔烴、氰、疊氮化物等外源基團的化合物作為RRs用于構建SERS標簽也有效解決了部分問題。同時，快速、效率高、通量高的前處理方法應與生物傳感器相結合以消除部分基質效應。3）高通量、快速準確是農藥殘留檢測方法的發展趨勢，傳統RRs指紋圖譜復雜易重合，不利于多殘留方法的構建，因此增加特征峰不易重合的外源化合物可用種類顯得非常重要。4）識別元件決定傳感器的特異性，但受環境影響較大，且現有的種類依然不能滿足靶標多樣性的需求，應提高識別元件的性能，并加強不同靶標識別元件的研究。5）簡單、快速、低成本、可現場檢測及高通量檢測平臺應與SERS標記技術生物傳感相結合，如陣列試紙條、微流控芯片，陣列檢測板等，并配套開發可多通路同時檢測的便攜式拉曼光譜儀。總之，相信隨著研究的深入，SERS標記技術將能夠更加有效地應用于農藥殘留檢測，并拓展到食品安全檢測。