溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶的研究進(jìn)展

肖 寒，劉秀妨，鄭 淋，趙謀明，黃明濤

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的一類蛋白質(zhì)，占體內(nèi)總蛋白含量的30%以上，廣泛分布于皮膚、動(dòng)脈、肌腱、軟骨和大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)中。膠原蛋白含有大量重復(fù)的“Gly-X-Y”氨基酸序列（Gly為甘氨酸；X、Y為任意氨基酸，其中X主要為脯氨酸，Y主要為羥脯氨酸），可形成三股肽鏈規(guī)律纏繞的螺旋結(jié)構(gòu)，從而賦予膠原蛋白較高的機(jī)械強(qiáng)度及穩(wěn)定性。膠原蛋白的這一特性在支持組織結(jié)構(gòu)和保護(hù)機(jī)體器官上具有重要作用，但是卻因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、難以水解，導(dǎo)致蛋白利用率較低。目前，水解膠原蛋白的方法主要有化學(xué)法和酶法。化學(xué)法主要通過酸或堿作用使膠原蛋白纖維溶脹，肽鍵斷裂。此類方法經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，但是水解率較低，易破壞氨基酸結(jié)構(gòu)，所得膠原蛋白肽質(zhì)量不高。酶法水解條件溫和，普通蛋白酶（如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶等）酶解時(shí)，通過化學(xué)法或高溫輔助使膠原蛋白分子變性為明膠則更利于深度水解。而膠原蛋白酶是一種能在生理?xiàng)l件下識(shí)別天然膠原蛋白特殊三股螺旋區(qū)域，并對(duì)其進(jìn)行水解的蛋白酶。使用膠原蛋白酶水解膠原蛋白更易獲得具有生物活性的膠原蛋白肽，是提高膠原蛋白水解水平的重要手段。

膠原蛋白酶主要存在于微生物和動(dòng)物中，在少數(shù)植物中也見報(bào)道。它們通常以鋅離子和鈣離子為輔因子，具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，在催化結(jié)構(gòu)域中存在保守的鋅結(jié)合基序HEXXH（圖1A）。相較于動(dòng)物源膠原蛋白酶，微生物源膠原蛋白酶的分子質(zhì)量普遍更大、結(jié)構(gòu)域更復(fù)雜（圖1B）、底物適應(yīng)性更強(qiáng)，且未發(fā)現(xiàn)存在酶原形式，無需通過激活酶原產(chǎn)生酶活性。目前已經(jīng)篩選到多種可分泌膠原蛋白酶的菌株，如溶組織梭狀芽孢桿菌（，現(xiàn)更名為）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（）、破傷風(fēng)梭菌（）和蠟樣芽孢桿菌（）等。其中，以來源于溶組織梭狀芽孢桿菌的膠原蛋白酶研究最為廣泛，是目前公認(rèn)的用于鑒定分析新型膠原蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)酶，也是可商品化獲取的微生物源膠原蛋白酶。

圖1 微生物源和動(dòng)物源膠原蛋白酶序列及結(jié)構(gòu)域比較Fig. 1 Comparison of the sequence and domain of collagenase from microbial and animal sources

1953年，Mandl等首次通過示差沉淀法從溶組織梭狀芽孢桿菌的發(fā)酵液中分離出含有膠原蛋白酶的組分。隨后，Yoshihara和Matsushita等研究發(fā)現(xiàn)溶組織梭狀芽孢桿菌可分泌兩種不同的膠原蛋白酶ColG和ColH。根據(jù)兩種膠原蛋白酶對(duì)天然膠原蛋白底物和特異性合成肽底物FALGPA（-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala）水解活性的差異，ColG和ColH又分別稱為I型膠原蛋白酶（對(duì)天然膠原蛋白的水解活性較高）和II型膠原蛋白酶（對(duì)FALGPA水解活性較高）。近年來，學(xué)者圍繞兩種膠原蛋白酶進(jìn)行了大量的研究報(bào)道。本文在國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，對(duì)溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶的結(jié)構(gòu)特征、水解機(jī)理、生產(chǎn)現(xiàn)狀和實(shí)際應(yīng)用等進(jìn)行歸納總結(jié)，并對(duì)其未來的研究方向進(jìn)行展望，以期能夠?yàn)槲⑸镌茨z原蛋白酶的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 微生物源膠原蛋白酶結(jié)構(gòu)特征

微生物源膠原蛋白酶通常具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖2），分別是前肽、激活結(jié)構(gòu)域、肽酶結(jié)構(gòu)域、PKD和CBD。按照其功能又可將激活結(jié)構(gòu)域和肽酶結(jié)構(gòu)域歸為催化功能模塊，將PKD和CBD歸為膠原募集模塊。膠原募集模塊的差異也是不同菌種來源的膠原蛋白酶在結(jié)構(gòu)差異性上的重要體現(xiàn)。

圖2 微生物源膠原蛋白酶結(jié)構(gòu)域比對(duì)Fig. 2 Domains of different microbial collagenases

1994年，Yoshihara等從溶組織梭狀芽孢桿菌JCM 1403中克隆膠原蛋白酶基因，發(fā)現(xiàn)該基因的開放閱讀框含有3 066 個(gè)堿基對(duì)，共編碼1 021 個(gè)氨基酸。1999年，Matsushita等從溶組織梭狀芽孢桿菌JCM 1403的培養(yǎng)上清液中純化出與ColH的N末端氨基酸序列不同的膠原蛋白酶ColG，該蛋白含有1 118 個(gè)氨基酸，由（3 357 bp）編碼。

前肽可進(jìn)一步分為信號(hào)肽和前導(dǎo)肽。ColG的前肽包括110 個(gè)氨基酸，其中前45 個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。而ColH的前肽為40 個(gè)氨基酸，前30 個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。信號(hào)肽是引導(dǎo)新合成蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌通路的短肽，可將蛋白質(zhì)定位到含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器中。但是，目前膠原蛋白酶在溶組織梭狀芽孢桿菌中的具體分泌途徑未知，該信號(hào)肽介導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌區(qū)域尚不清楚。Eckhard和Ducka等在大腸桿菌中重組表達(dá)膠原蛋白酶時(shí)發(fā)現(xiàn)缺少前肽序列也可以得到具有催化活性的膠原蛋白酶，認(rèn)為該結(jié)構(gòu)并不是蛋白正確折疊所必需的。

肽酶結(jié)構(gòu)域是發(fā)揮膠原蛋白肽水解活性的重要結(jié)構(gòu)，當(dāng)其單獨(dú)存在時(shí)，其水解短肽的能力與全長(zhǎng)膠原蛋白酶相近，但卻喪失了水解天然膠原蛋白的活性。當(dāng)激活結(jié)構(gòu)域與肽酶結(jié)構(gòu)域共同存在時(shí)，水解天然膠原蛋白的活性恢復(fù)。溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶是擁有多模塊結(jié)構(gòu)的鋅金屬蛋白酶，其N端的肽酶結(jié)構(gòu)域中具有保守的HEXXH鋅結(jié)合基序，該基序與其下游間隔28～32 個(gè)氨基酸的另一谷氨酸共同形成鋅離子配位結(jié)構(gòu)。Eckhard等解析了ColG的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Zn與His523、His527、Glu555和一個(gè)水分子可形成一個(gè)四面體結(jié)構(gòu)，水分子以氫鍵的形式與Glu524相連。Sch?nauer等解析了ColH與抑制劑復(fù)合時(shí)的晶體結(jié)構(gòu)，認(rèn)為His455、Glu456、His459和Glu487與Zn形成配位結(jié)構(gòu)。

膠原募集模塊中的CBD可特異性地識(shí)別結(jié)合膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，是膠原蛋白酶水解不溶性天然膠原蛋白的重要結(jié)構(gòu)，其傾向于結(jié)合在膠原蛋白三股螺旋較松散的部分。PKD與膠原蛋白的結(jié)合不緊密，但可以進(jìn)一步強(qiáng)化CBD與纖維狀膠原蛋白的結(jié)合能力。如圖3所示，ColG含有兩個(gè)串聯(lián)CBD和一個(gè)PKD，Ca的存在可以使ColG中兩個(gè)CBD之間的連接部分由-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)?折疊，增強(qiáng)CBD與膠原蛋白的結(jié)合，也使其不易被其他蛋白酶水解，提高了全長(zhǎng)膠原蛋白酶的穩(wěn)定性。ColH含有一個(gè)CBD和兩個(gè)PKD，CBD可以沿著膠原蛋白纖維滑動(dòng)，找到更容易水解的位點(diǎn)，兩個(gè)PKD的存在使其對(duì)膠原蛋白的親和力更強(qiáng)。根據(jù)這一結(jié)構(gòu)特征，二者可協(xié)同水解膠原蛋白，即ColG先錨定在膠原蛋白纖維最脆弱的區(qū)域使原纖維溶脹，ColH結(jié)合在這些溶脹的區(qū)域進(jìn)行水解。

圖3 ColG和ColH的結(jié)構(gòu)示意圖[21,23]Fig. 3 Structures of ColG and ColH[21,23]

此外，膠原蛋白酶譜實(shí)驗(yàn)表明，這兩種酶除了116 kDa的全長(zhǎng)形式，對(duì)C末端部分水解還可得到若干殘余的N末端（如源自ColG的67、78 kDa和82 kDa片段；源自ColH的98、105 kDa片段），且依舊具有酶解明膠的能力，因而也被稱為明膠酶。這些殘余片段對(duì)明膠的酶解活性甚至高于全長(zhǎng)形式的膠原蛋白酶，但只有全長(zhǎng)的膠原蛋白酶才能消化不溶性膠原蛋白，這也說明膠原蛋白酶C末端的膠原募集模塊在水解天然膠原蛋白中發(fā)揮了重要作用。

2 膠原蛋白酶的水解機(jī)理

2011年，Eckhard等首次對(duì)膠原蛋白酶ColG進(jìn)行整體晶體結(jié)構(gòu)解析，并通過分別異源表達(dá)該酶各個(gè)結(jié)構(gòu)域推測(cè)其水解膠原蛋白和微原纖維膠原蛋白（由5 條三股螺旋纏繞而成）的機(jī)理，大致分為以下3 個(gè)步驟，如圖4所示。

圖4 膠原蛋白和微原纖維膠原蛋白的水解模型[21]Fig. 4 Collagenolytic models of triple-helical and microfibrillar collagen[21]

首先膠原蛋白酶的肽酶結(jié)構(gòu)域與膠原蛋白三股螺旋結(jié)合（圖4A）；此時(shí)膠原蛋白酶處于開放狀態(tài)，激活結(jié)構(gòu)域未與底物相互作用，膠原蛋白尚未發(fā)生水解；隨后膠原蛋白酶閉合，激活結(jié)構(gòu)域與三股螺旋發(fā)生相互作用（圖4B）。水解過程中，膠原蛋白酶漸漸打開成半開放構(gòu)象，使3 個(gè)-鏈解旋并依次降解（圖4C）。在三股螺旋被徹底水解后，膠原蛋白酶便恢復(fù)至初始開放狀態(tài)，進(jìn)行下一輪水解。對(duì)于由5 條三股螺旋纏繞形成更為復(fù)雜的微原纖維膠原蛋白，水解步驟也大致相同，但每次只水解一個(gè)三股螺旋膠原蛋白，其余部分被排到酶外等待下一次水解（圖4D～F）。

膠原蛋白酶ColG和ColH的酶切位點(diǎn)都是膠原蛋白“Gly-X-Y”重復(fù)序列中Y與Gly之間的肽鍵，但二者底物偏好性不同，首選的切割位點(diǎn)也有差異（表1），共同存在時(shí)表現(xiàn)出對(duì)膠原蛋白的協(xié)同降解作用。ColG的首選底物為三股螺旋膠原蛋白，首選切割位點(diǎn)為N末端和C末端。而ColH水解底物的親和力從大到小依次為多肽、變性膠原蛋白和三股螺旋膠原蛋白，首選切割位點(diǎn)為序列內(nèi)部。

表1 I型和II型溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶的特性Table 1 Characteristics of type I and type II collagenases from Clostridium histolyticum

Eckhard等利用蛋白酶裂解位點(diǎn)的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定（proteomic identification of protease cleavage sites，PICS）分析了膠原蛋白酶ColG和ColH的切割位點(diǎn)特異性，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白酶ColG和ColH在P2和P2’位置顯示出對(duì)Pro的明顯偏好，在P3和P1’中顯示出對(duì)Gly的偏好。這與典型膠原蛋白中大量存在的Gly-Pro-X和Gly-X-Hyp序列一致，解釋了溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶水解天然膠原蛋白的高度特異性。

3 膠原蛋白酶活力檢測(cè)方法

膠原蛋白酶的酶活力檢測(cè)方法主要有平板法、顯色法和熒光法等。

平板法可用于初步篩選具有膠原蛋白水解活性的菌株。具體方法是將具有膠原蛋白酶活性的菌株在明膠平板上進(jìn)行培養(yǎng)后，用酸性汞試劑處理平板，未被降解的明膠變性沉淀，可觀察到菌落周圍出現(xiàn)水解圈，通過水解圈與菌落直徑比值的大小可以初步判斷該菌株分解膠原蛋白能力的強(qiáng)弱。該方法操作簡(jiǎn)便，可用于初步鑒定膠原蛋白酶水解活性，但是水解圈大小根據(jù)觀察時(shí)間不同而有所區(qū)別，且靈敏度較低，多用于定性檢測(cè)。

顯色法中，茚三酮顯色法是一種常規(guī)的膠原蛋白酶酶活檢測(cè)方法，通過酶水解底物釋放至體系中游離氨基酸的含量來表征膠原蛋白酶的水解活力。該方法通常以可溶性膠原蛋白、不溶性膠原蛋白和變性膠原蛋白明膠等作為底物，以甘氨酸或亮氨酸的生成當(dāng)量來定義酶活力單位U。Zhang Yanfang等對(duì)常規(guī)的茚三酮顯色法進(jìn)行優(yōu)化，將660 μg明膠溶解在343 μL反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，含有5 mmol/L CaCl和1 μmol/L ZnCl）中，加入7 μL質(zhì)量濃度1 mg/mL膠原蛋白酶，37 ℃孵育，再加入等量終止液（含有12%（/）聚乙二醇6000和25 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉）終止反應(yīng)。隨后取100 μL反應(yīng)液加入500 μL茚三酮顯色試劑，80 ℃水浴10 min，冷卻后再加入500 μL HO并混合均勻，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。優(yōu)化后反應(yīng)形成的紫色絡(luò)合物更加穩(wěn)定，且不需要強(qiáng)酸沉淀、離心和其他額外處理來去除未反應(yīng)底物和膠原蛋白酶。該方法經(jīng)濟(jì)方便，但是特異性低，若未經(jīng)純化直接取培養(yǎng)液上清進(jìn)行測(cè)定，容易受到菌株分泌的其他蛋白酶或者培養(yǎng)液中殘留氨基酸的影響，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。

除了以天然或變性膠原蛋白為底物，一些人工合成的特異性底物也常用于膠原蛋白酶活力的檢測(cè)，如Azocoll、FALGPA（-(3-[2-furyl]acryloyl)--leucylglycyl--prolyl--alanine）和Pz-PLGPA（PZ--prolyl--leucyl-glycyl--prolyl--arginine）等。Azocoll是一種與偶氮染料連接的膠原蛋白，被膠原蛋白酶水解后染料釋放，可通過測(cè)定520 nm波長(zhǎng)處吸光度來計(jì)算酶活力。FALGPA和Pz-PLGPA是人工合成的膠原蛋白酶寡肽底物，不易被其他蛋白酶水解。其中，F(xiàn)ALGPA是美國(guó)Sigma-Aldrich公司用來定義膠原蛋白酶產(chǎn)品酶活力的常用底物，通過測(cè)定酶與底物反應(yīng)后345 nm波長(zhǎng)處吸光度的減少量計(jì)算水解量，1 個(gè)FALGPA unit指在25 ℃、pH 7.5的條件下，每分鐘水解1 μmol的FALGPA。而Pz-PLGPA法則以反應(yīng)后在320 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度的增量定義酶活力單位，1 個(gè)PZ unit指在25 ℃、pH 7.1的條件下，每分鐘催化水解1 μmol的Pz-PLGPA。此類方法通常較為靈敏，且測(cè)得的酶活力較準(zhǔn)確，但使用合成短肽作為底物測(cè)得的酶活力不能直接體現(xiàn)該膠原蛋白酶對(duì)天然膠原蛋白的水解活性。

除了這些常見的底物，Saikumari等合成了一種新的熒光底物，能專一地被溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶切割而不受其他蛋白酶影響，該底物水解后受336 nm激發(fā)光激發(fā)后，在490 nm波長(zhǎng)處的發(fā)射熒光顯著增強(qiáng)，反應(yīng)快速靈敏。Go等利用鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）與游離氨基酸結(jié)合產(chǎn)生熒光的特點(diǎn)，在膠原蛋白酶與底物反應(yīng)后的反應(yīng)液中加入質(zhì)量濃度1 mg/mL OPA（0.1 mol/L PBS，pH 7.4），被360 nm激發(fā)光激發(fā)后，檢測(cè)460 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度。此類方法快捷靈敏，能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量數(shù)據(jù)，但熒光試劑通常較為昂貴，檢測(cè)成本較高。

除了上述方法，膠原蛋白酶譜法也用于膠原蛋白酶活力的檢測(cè)。膠原蛋白酶譜法是一種基于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的檢測(cè)方法。樣品在含有底物蛋白的聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離或在電泳后將凝膠浸泡在底物溶液中，再通過孵育、染色、脫色的方法顯示條帶。一般使用考馬斯亮藍(lán)染色后脫色，在藍(lán)色背景下可觀察到白色條帶（底物降解后不被著色），條帶的灰度與膠原蛋白酶活力成正比。Inanc等用含有質(zhì)量濃度0.3 mg/mL提取自鼠尾肌腱的I型膠原蛋白的凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)去除SDS、孵育、染色、脫色后可見清晰條帶。該方法十分靈敏，檢測(cè)限可低至1 ng膠原蛋白酶，并且可以基于膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線來量化未知樣品中的膠原蛋白酶活力性水平。此外，膠原蛋白與膠原蛋白酶的酶解反應(yīng)引起的物理變化（例如濁度和黏度的變化）也被用于分析膠原蛋白酶酶活力。

4 膠原蛋白酶生產(chǎn)現(xiàn)狀

4.1 發(fā)酵生產(chǎn)

目前商業(yè)化的膠原蛋白酶主要來自溶組織梭狀芽孢桿菌，通過培養(yǎng)溶組織梭狀芽孢桿菌再?gòu)钠渑囵B(yǎng)上清液中分離純化所需的膠原蛋白酶。該方法的優(yōu)勢(shì)在于溶組織梭狀芽孢桿菌將膠原蛋白酶分泌到培養(yǎng)基中，可以在簡(jiǎn)單的液體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，獲得膠原蛋白酶的效率較高。但該方法所得的膠原蛋白酶粗制劑中還含有棕色色素、梭菌蛋白酶、氨基肽酶和幾種中性蛋白酶。梭菌蛋白酶的存在導(dǎo)致粗酶制劑會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞和胰島細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，也會(huì)導(dǎo)致純化后期和貯存運(yùn)輸過程中膠原蛋白酶的降解。上清液中其他酶類以及多種C末端截短的膠原蛋白酶的存在增加了膠原蛋白酶分離純化時(shí)工藝的難度，且容易造成不同批次的膠原蛋白酶粗制劑活性差異較大。目前，研究人員主要從優(yōu)化溶組織梭狀芽孢桿菌的培養(yǎng)基和改進(jìn)純化方式兩大方面著手提高膠原蛋白酶的純度。

Wegman等采用以植物氮源為主的培養(yǎng)基培養(yǎng)溶組織梭狀芽孢桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低葡萄糖質(zhì)量濃度（質(zhì)量濃度小于5 g/L）和增加鹽質(zhì)量濃度（質(zhì)量濃度大于5 g/L）能顯著降低梭菌蛋白酶的含量，純化過程可以在室溫下進(jìn)行，并且無需添加蛋白酶抑制劑，所得的膠原蛋白酶制劑酶活與標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白酶相當(dāng)，純度大于95%，在4 ℃存放17 d后仍能保持活性且未見降解。該方法分離的得到的I型膠原蛋白酶以可溶性鼠尾膠原蛋白（soluble rat tail collagen，SRC）為底物測(cè)得酶活力為1 967～3 327 U/mg，II型膠原蛋白酶以合成肽Carbobenzooxy-glycyl--prolylglycyl-glycyl--prolyl--alanine（zGPGGPA）為底物，測(cè)得酶活力為81 934～119 522 U/mg。

Sabatino等采用非動(dòng)物源性培養(yǎng)基培養(yǎng)strains 004制備冷凍保存的菌種庫(kù)，以蛋白胨為主要氮源制備培養(yǎng)液，并采用分批補(bǔ)料發(fā)酵方式進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)0.2 μm過濾器、離子交換色譜、疏水層析和切向流過濾得到純化的膠原蛋白酶，總產(chǎn)量為280～350 mg/L，純度大于97%。該方法可以擴(kuò)大到20 L規(guī)模發(fā)酵，且批次質(zhì)量穩(wěn)定，分離的得到的I型膠原蛋白酶以SRC為底物，測(cè)得酶活力為1 700～3 500 U/mg，II型膠原蛋白酶以合成肽zGPGGPA為底物，測(cè)得酶活力為43 000～69 000 U/mg。

4.2 異源表達(dá)

為獲取較高純度的膠原蛋白酶，以便進(jìn)一步對(duì)膠原蛋白酶的生化性質(zhì)、酶結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理、構(gòu)效關(guān)系展開研究，同時(shí)拓展其在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用，研究人員嘗試通過基因工程的手段重組表達(dá)生產(chǎn)膠原蛋白酶。目前相關(guān)研究已經(jīng)在不同的表達(dá)體系中開展，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等。

大腸桿菌具有生長(zhǎng)迅速、遺傳背景清晰、易于基因編輯等優(yōu)點(diǎn)，是研究最廣泛的模式生物。1994年，Yoshihara等在大腸桿菌中首次克隆了源自溶組織梭狀芽孢桿菌的膠原蛋白酶基因。隨后，相關(guān)的重組表達(dá)研究陸續(xù)開展。2009年，Ducka等在大腸桿菌中表達(dá)和純化了溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶ColG和ColH，即以pMBP-Parallel2為載體，BL21為宿主進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，采用固定化金屬親和色譜初步純化、直鏈淀粉親和色譜再次純化，去除N端標(biāo)簽后再采用離子交換色譜和尺寸排阻色譜進(jìn)行最終純化，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)量濃度至少10 mg/L的產(chǎn)量，純度達(dá)到95%。Bertuzzi等通過密碼子優(yōu)化、可溶性優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化等策略，將密碼子優(yōu)化后的膠原蛋白酶ColG和ColH基因序列分別克隆到pMAL-c2X載體中，轉(zhuǎn)化菌株接種到TB培養(yǎng)基（補(bǔ)充有質(zhì)量濃度100 μg/mL氨芐青霉素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%葡萄糖）中，30 ℃、260 r/min培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD≈0.6時(shí)加入終濃度0.3 mmol/L的異丙基---硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，30 ℃、260 r/min培養(yǎng)3 h可獲得約質(zhì)量濃度160 mg/L的ColG或ColH。與市售的溶組織梭狀芽孢桿菌源膠原蛋白酶相比，該重組膠原蛋白酶以Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala為底物時(shí)酶活力約是Liberase（瑞士Roche公司）的1.7 倍，且在處理胰島細(xì)胞時(shí)，僅用NB 8 Broad Range（德國(guó)NordMark公司）1/5的酶量便可達(dá)到相同的提取效果。

除了以大腸桿菌為表達(dá)載體，膠原蛋白酶也可在其他原核體系進(jìn)行異源表達(dá)。1996年，Jung等采用DB104異源表達(dá)ColH，發(fā)現(xiàn)相比LB培養(yǎng)基，表達(dá)載體在含有0.5 mol/L琥珀酸鈉的改良LB培養(yǎng)基中穩(wěn)定性較高。重組膠原蛋白ColH產(chǎn)量約為0.66 mg/L，以Pz-PLGPA為底物測(cè)得酶活力為1 210 U/mg。1998年，Matsushita等也在DB104中表達(dá)了C末端融合GST標(biāo)簽的ColH，以Pz-PLGPA為底物測(cè)得酶活力為771.5 U/mg，以I型膠原蛋白為底物測(cè)得酶活力為1 413.8 U/mg。此外，2008年Tamai等構(gòu)建了質(zhì)粒pFN，在產(chǎn)氣莢膜梭菌中表達(dá)了C末端帶有6×His標(biāo)簽的膠原蛋白酶ColH，純化得到的蛋白質(zhì)量濃度約10 mg/L，以Pz-PLGPA為底物測(cè)得酶活力為1 028 U/mg，以I型膠原蛋白為底物測(cè)得酶活力為1 216 U/mg。他們發(fā)現(xiàn)C末端帶有6×His標(biāo)簽的膠原蛋白酶對(duì)I型膠原蛋白的水解活性較不帶標(biāo)簽的ColH低，推測(cè)是由于C末端的6×His標(biāo)簽影響CBD結(jié)構(gòu)域與膠原蛋白的親和力，從而影響膠原蛋白酶對(duì)不溶性膠原蛋白的水解活性。此外，在膠原蛋白酶N末端的6×His標(biāo)簽對(duì)其酶活也有一定影響，這可能是由于6×His標(biāo)簽干擾了催化活性中心Zn的正確定位從而影響了膠原蛋白酶的活力。目前溶組織梭狀芽孢桿菌源膠原蛋白酶的異源表達(dá)主要集中在原核體系（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌），真核體系中的研究報(bào)道較少。大腸桿菌表達(dá)體系可以實(shí)現(xiàn)異源蛋白的高水平表達(dá)，膠原蛋白酶的產(chǎn)量已到達(dá)160 mg/L。該系統(tǒng)具有豐富的功能元件和完善的分子遺傳操作平臺(tái)，有利于研究的深入開展，但是該系統(tǒng)容易形成包涵體，有待通過研究提高可溶性膠原蛋白酶的產(chǎn)量。枯草芽孢桿菌表達(dá)體系具有高效的蛋白胞外分泌能力，且無明顯的密碼子偏好性，但是該系統(tǒng)存在質(zhì)粒不穩(wěn)定的問題，可用的生物元件相對(duì)較少。產(chǎn)氣莢膜梭菌與溶組織梭狀芽孢桿菌同源性高，有利于溶組織梭狀芽孢桿菌源膠原蛋白酶的正確折疊表達(dá)，但是該系統(tǒng)在代謝工程中應(yīng)用較少。真核系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，如糖基化和磷酸化等，也能實(shí)現(xiàn)胞外分泌及可溶性表達(dá)，利于下游純化，但是目前溶組織梭狀芽孢桿菌源膠原蛋白酶在真核生物中的異源表達(dá)鮮見報(bào)道。在畢赤酵母中進(jìn)行基礎(chǔ)表達(dá)的研究曾有報(bào)道，但未進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，也未進(jìn)一步對(duì)表達(dá)所得的膠原蛋白酶進(jìn)行純化研究。

綜上所述，溶組織梭狀芽孢桿菌源膠原蛋白酶異源表達(dá)的產(chǎn)量和酶活力仍有待提升，需綜合考量酶自身特性和宿主的蛋白分泌特征，利用相應(yīng)的代謝工程手段進(jìn)行全局調(diào)控從而實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。

5 膠原蛋白酶的實(shí)際應(yīng)用

5.1 生物醫(yī)藥

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其異常的合成和積累常常會(huì)導(dǎo)致纖維化相關(guān)疾病，因此，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域常采用注射膠原蛋白酶的手段治療相關(guān)疾病，如腰椎間盤突出、掌筋膜攣縮和佩羅尼病等。掌筋膜攣縮是掌腱筋膜中膠原蛋白的沉積導(dǎo)致掌指關(guān)節(jié)發(fā)生攣縮，使手指的正常功能受損的疾病，多發(fā)于中老年男性。2010年2月美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)了溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶用于掌筋膜攣縮的非手術(shù)療法。膠原蛋白酶注射療法與掌筋膜切斷術(shù)等手術(shù)療法相比具有副作用更少、作用溫和、患者滿意度高等優(yōu)勢(shì)。Syed等的體外研究表明溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶能有效地消化病灶處的細(xì)胞外基質(zhì)，而不會(huì)對(duì)非膠原組織成分產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性或結(jié)構(gòu)損傷，但該方法也存在復(fù)發(fā)率較高的問題。Villegas等制備了一種膠原蛋白酶納米膠囊，并在局部真皮纖維化的小鼠模型中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。該膠囊可在生理?xiàng)l件下逐漸釋放封裝的膠原蛋白酶，藥效最長(zhǎng)可達(dá)10 d。與注射游離膠原蛋白酶相比，注射膠原蛋白酶納米膠囊的小鼠真皮纖維化面積顯著減少，且并未觀察到其他不良影響。

膠原蛋白酶還可應(yīng)用于傷口清創(chuàng)，清除傷口處壞死或污染的組織有助于傷口的恢復(fù)，對(duì)于一些慢性、不愈合的傷口具有較好的效果，在臨床上應(yīng)用廣泛。以溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶為主要成分的膠原蛋白酶軟膏Santyl是唯一一種獲得FDA批準(zhǔn)用于傷口和燒傷清創(chuàng)的酶制劑。研究表明，溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶可以在7 個(gè)特定的位點(diǎn)對(duì)膠原蛋白進(jìn)行切割，清除壞死組織的同時(shí)也產(chǎn)生一些副產(chǎn)物（生物活性肽），可以刺激成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，改善傷口的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管生成和傷口愈合。Waycaster等對(duì)使用Santyl軟膏治療慢性皮膚潰瘍的臨床效果和治療成本進(jìn)行了分析，認(rèn)為膠原蛋白酶軟膏無論是單獨(dú)使用或是輔以其他的治療手段均可以有效清創(chuàng)，且不受使用群體和診療環(huán)境的限制。與使用水凝膠敷料或手術(shù)清創(chuàng)的方法相比，使用膠原蛋白酶治療的患者復(fù)診清創(chuàng)的次數(shù)更少，傷口恢復(fù)更快，綜合而言花費(fèi)的治療成本較低。此外，膠原蛋白酶還用于治療青光眼、子宮肌瘤、慢性完全閉塞病變、基因治療等方面，相關(guān)的臨床研究有待進(jìn)一步發(fā)展。

細(xì)胞培養(yǎng)是分子生物學(xué)、生物技術(shù)以及生物制藥等研究和產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的重要技術(shù)，有效的細(xì)胞分離是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通常使用酶來使細(xì)胞組織解聚。由于膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分且膠原蛋白酶不損傷細(xì)胞膜，用膠原蛋白酶處理含有大量膠原纖維的組織后，可獲得各種細(xì)胞功能正常、形狀完整且存活率高的細(xì)胞，多年來已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分散、組織分離和實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)，成功用于分離骨骼肌干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪基質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及胰島等。Ishii等利用膠原蛋白酶分離得到的骨骼肌干細(xì)胞保留了細(xì)胞的表面抗原，并且具有良好的再生能力。胰蛋白酶雖然也常用于細(xì)胞解離，但天然膠原蛋白的三股螺旋區(qū)對(duì)胰蛋白酶有較強(qiáng)的抵抗作用。因此，對(duì)于一些高膠原蛋白含量的纖維組織和對(duì)胰蛋白酶敏感的組織更適合使用膠原蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞分離，二者與其他酶復(fù)合使用可以得到更好的分離效果。

5.2 食品加工

在食品工業(yè)中，使用酶來輔助食品加工是常見的方法，它可以提高食品的營(yíng)養(yǎng)和功能特性。在膠原蛋白酶的作用下，膠原蛋白被水解成膠原蛋白肽。研究表明攝入膠原蛋白肽可能有助于機(jī)體合成膠原蛋白，具有多種健康益處，如改善皮膚健康、減緩關(guān)節(jié)疼痛和預(yù)防骨質(zhì)疏松等。Yang Xinghao等利用膠原蛋白酶水解魚骨、魚皮、魚鱗等海產(chǎn)品副產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)水解物具有較高的抗氧化活性。Song Yihang等利用重組膠原蛋白酶水解牛骨膠原蛋白，通過響應(yīng)面法優(yōu)化水解條件，使用質(zhì)量濃度110 μg/mL的膠原蛋白酶在35 ℃、pH 8條件下制得可溶性膠原蛋白肽，并從中鑒定出5 種新型抗氧化肽。Yi Jierong等使用膠原蛋白酶水解草魚魚皮得到的水解物具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性和抗氧化活性，可用于開發(fā)降血壓功能性食品，還能延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。2020年6月，美國(guó)膠原蛋白品牌Vital Proteins多數(shù)股權(quán)被雀巢健康科學(xué)收購(gòu)，這是其首次收購(gòu)膠原蛋白生產(chǎn)企業(yè)，標(biāo)志著行業(yè)巨頭對(duì)膠原蛋白領(lǐng)域的重視。近年來，我國(guó)膠原蛋白市場(chǎng)處于蓬勃發(fā)展階段，2019年中國(guó)膠原蛋白的市場(chǎng)規(guī)模增長(zhǎng)至9.83億 美元，約占全球市場(chǎng)的6.40%，預(yù)計(jì)到2027年，中國(guó)膠原蛋白的市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到15.76億 美元，膠原蛋白肽作為功能食品配料和膳食補(bǔ)充劑具有可觀的應(yīng)用前景。

在肉類嫩化方面，肉的嫩度與結(jié)締組織中膠原蛋白的含量密切相關(guān)，膠原蛋白水解酶可以通過消化膠原蛋白使肉變嫩，并在肉制品中產(chǎn)生良好的風(fēng)味，因此在肉類工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。其他動(dòng)植物蛋白酶對(duì)底物的特異性不強(qiáng)，用其處理肉制品可能會(huì)帶來一些不良的風(fēng)味，影響肉制品的感官品質(zhì)，而用膠原蛋白酶處理能針對(duì)性地水解膠原蛋白，降低結(jié)締組織的韌性使肉類嫩化。

6 結(jié) 語

溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶可高效水解膠原蛋白，在生物醫(yī)藥、食品加工等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用，是最具代表性的微生物源膠原蛋白酶。目前，對(duì)溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶的組成和結(jié)構(gòu)已有了較為清晰的認(rèn)識(shí)，同時(shí)該酶也在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，但是仍然有以下問題有待解決。

在分泌機(jī)制方面，膠原蛋白酶在溶組織梭狀芽孢桿菌中的具體分泌機(jī)制未知，前導(dǎo)肽的具體功能作用及ColG和ColH分子截短形式的產(chǎn)生機(jī)理有待研究。在酶產(chǎn)量方面，針對(duì)純化標(biāo)簽對(duì)膠原蛋白酶活力的影響以及蛋白產(chǎn)量低等問題，可通過選擇不同的表達(dá)體系（如嘗試真核表達(dá)體系：釀酒酵母或畢赤酵母等），并對(duì)異源表達(dá)體系進(jìn)行代謝途徑改造來進(jìn)一步提高生產(chǎn)效率。在實(shí)際應(yīng)用方面，為提高膠原蛋白酶的穩(wěn)定性和生物利用度，還可通過包埋法、吸附法和共價(jià)結(jié)合法等對(duì)膠原蛋白酶進(jìn)行固定化。在酶學(xué)性質(zhì)拓展方面，可利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)進(jìn)行酶工程化改造提高酶活力、穩(wěn)定性和底物特異性等。此外，由于膠原蛋白酶為模塊化酶，可對(duì)不同膠原蛋白酶的優(yōu)勢(shì)模塊進(jìn)行交換，獲取更具有優(yōu)勢(shì)的膠原蛋白酶。