褪黑素對低溫貯藏期間薺菜衰老和抗氧化能力的影響

王潔瓊，王軍萍，朱麗娟，郁志芳

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

葉菜是我國主要的栽培和消費蔬菜，其中薺菜作為一種藥食同源的特色葉菜深受消費者的喜愛。薺菜富含多種有機酸和氨基酸，無機物中鉀、鈣、鈉、鐵等含量較高，具有促進子宮收縮、止血、降低血壓以及調(diào)節(jié)睡眠的功效。薺菜生產(chǎn)和銷售的季節(jié)性較強、常溫保鮮困難、品質劣變快，縮短了其市場供應時間。因此，采用保鮮技術來延長薺菜的貯藏時間，維持采后新鮮薺菜品質具有重要意義。

果蔬衰老劣變與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的調(diào)節(jié)密切相關。ROS是果蔬生理代謝的必然產(chǎn)物，當其含量積累超過果蔬的氧化防御范圍時，就會引起細胞損傷甚至死亡。植物的抗氧化系統(tǒng)是維持ROS穩(wěn)態(tài)水平的關鍵，主要分為兩類，一類是非酶抗氧化體系，主要包括抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、多酚、花青素等抗氧化物質；一類是酶促抗氧化體系，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）等。當果蔬中產(chǎn)生過多的ROS時，這兩套體系將會通過協(xié)同作用清除ROS，從而維持ROS產(chǎn)生和清除系統(tǒng)的平衡。

褪黑素是一種吲哚類小分子物質，化學名稱為-乙酰基-5-甲氧基色胺。1958年Lemer等首次從牛的松果體中提取出褪黑素，1995年Dubbels等首次在對煙草的研究中發(fā)現(xiàn)了褪黑素。近年來，褪黑素作為一種安全綠色的保鮮劑成為研究熱點。已有文獻證明外源褪黑素處理具有抑制葉綠素降解和提高果蔬抗氧化能力的效果，Park等以大麥葉片作為研究對象，使用褪黑素處理延緩了黑暗誘導的大麥葉片黃化，與對照組相比，最后一天處理組葉綠素含量是對照組的1.9 倍；王平以‘寒富’蘋果為實驗試材，向干旱脅迫下的蘋果植株根部定期噴施適宜濃度的褪黑素溶液，結果發(fā)現(xiàn)，第60天時處理組葉綠素含量為1.9 mg/g，是對照組的3.8 倍；杜卓等以‘鄭單958’玉米種子為研究對象，采用不同濃度褪黑素處理樣品，在葉面噴淋5 d后，葉綠素相對含量顯著高于對照組，提高了8.52%；Ma Qiuxiang等研究表明褪黑素處理能夠提高木薯SOD、CAT等抗氧化酶活力，減少ROS積累，延緩木薯采后衰老；賈樂等以0.5 mmol/L褪黑素處理香菇，結果顯示褪黑素可有效降低采后香菇ROS代謝產(chǎn)物生成速率，提高機體抗氧化能力；此外，褪黑素處理還可通過增強抗氧化酶活力以及抑制膜脂過氧化作用，有效維持桃果實的感官品質，提升桃果實的抗冷性，從而延長貯藏期。

以上研究表明，褪黑素作為一種新型保鮮劑，能夠有效抑制植物中葉綠素的降解，提升植物的抗氧化能力，具有良好的應用前景。有關褪黑素應于葉菜保鮮的研究鮮見報道。本實驗以薺菜為材料，探究外源褪黑素浸泡處理對貯藏期間薺菜葉綠素降解、葉綠體結構以及抗氧化能力的影響，以明確褪黑素對采后薺菜保鮮的作用機制，為其產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘板葉’薺菜 南京市江寧蔬菜種植基地。

乙醇、氫氧化鈉、正己烷、石油醚、乙醚、硼酸、亞硝酸鉀（均為分析純） 南京化學試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、3,5-二硝基水楊酸、鹽酸羥胺、-萘胺、四氯化鈦、TritonX-100、硫酸鈦（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；硫酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸（均為分析純） 廣東汕頭西隴化工廠；對氨基苯磺酸、核黃素、甲硫氨酸、谷胱甘肽還原酶、還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）（均為分析純） 上海伯奧生物科技有限公司；濃硫酸、濃鹽酸（均為分析純） 上海永億化學試劑有限公司；濃氨水、乙二胺四乙酸二鈉、丙酮、甲醇、2-乙烯吡啶（均為分析純） 上海凌峰化學試劑有限公司；三氯化鐵（分析純） 上海泗聯(lián)化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

Alpha-1860A紫外-可見分光光度計 上海譜元有限公司；Sartorius BS 224S型電子精密天平 德國賽多利斯公司；TGL16M臺式高速冷凍離心機 上海維爾康湘鷹離心機有限公司；CR-400 CHROMA METER色差儀 日本柯尼卡美能達公司；A11液氮研磨儀 德國艾卡有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；KQ-300DB數(shù)控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海益恒實驗儀器有限公司；Check Mate3氣體分析儀 丹麥Dansensor公司；FE20臺面式pH計 瑞士梅特勒有限公司；DDS-307電導儀 上海康儀儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 褪黑素處理

‘板葉’薺菜采后2 h內(nèi)運回實驗室，挑選葉片鮮綠、無病蟲害、無機械損傷、葉片表面積相近的薺菜用于實驗。分別設置不同濃度（5、10、100、200、500 μmol/L）褪黑素對薺菜進行浸泡處理，每5 L溶液浸泡1 kg薺菜，浸泡時間為10 min。前期預實驗通過對薺菜葉片色澤、葉綠素含量、呼吸、質量損失率等指標的測定，篩選得到100 μmol/L褪黑素處理效果最好，在該處理濃度下進一步探究了褪黑素處理對貯藏期間薺菜品質和抗氧化能力的影響。將實驗材料薺菜隨機分為2 組，實驗組（MT組）采用100 μmol/L褪黑素溶液浸泡10 min，每5 L溶液浸泡1 kg薺菜，對照組（CK組）用等體積蒸餾水浸泡10 min。浸泡結束后于20 ℃下晾至表面無水（約0.5 h），以每袋500 g分裝于黑色塑料袋，置于（2.0±0.5）℃條件下避光貯藏，分別于0、3、7、12 d和18 d隨機取5 袋樣品測定色澤、葉綠素含量、呼吸強度、超氧陰離子生成速率、HO含量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、葉綠素熒光參數(shù)和相對電導率。實驗設置3 個平行樣品。凍樣準備時，取薺菜葉片，切碎并混合均勻，用液氮速凍處理后置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 質量損失率的測定

每組樣品選取（500±10）g進行測定并設置3 個重復。分別稱量貯藏前后樣品質量，按下式計算質量損失率。

1.3.3 色澤的測定

采用CIELab表色系統(tǒng)測定樣品色澤（*值、）。用簽字筆進行點樣標記，標記取樣點，每次對固定葉片的取樣點進行測定。

1.3.4 葉綠體超微結構觀察

分別于0、7、18 d取樣進行超微結構的觀察，每組樣品取10 片具有代表性的葉片，切成約1 mm×3 mm×1 mm的薄片，在2.5%（質量分數(shù)）的戊二醛溶液中4 ℃固定8 h，然后按下列步驟處理樣品：倒掉固定液，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次，每次15 min；用1%（質量分數(shù)）的鋨酸溶液固定樣品1～2 h；小心取出鋨酸廢液，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3 次，每次15 min；依次用體積分數(shù)為30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種溶液處理15 min，再用無水乙醇處理2 次，每次20 min。用乙醇-醋酸異戊酯混合液（體積比為1∶1）處理樣品30 min，再用純醋酸異戊酯處理樣品1 h或放置3 h。臨界點干燥法干燥、噴金鍍膜。處理好的樣品通過SU-8010型掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.5 葉綠素含量測定

參照文獻[15]的方法測定薺菜中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量。單位為mg/g。

1.3.6 呼吸速率測定

將300 g薺菜樣品置于呼吸罐中密封2 h，然后使用Check Mate 3氣體分析儀測定呼吸速率。單位為mg/（kg·h）。

1.3.7 葉綠素熒光參數(shù)的測定

葉綠素最大熒光產(chǎn)量（）用于表征葉綠體光合作用反應中心活力的高低；表示基礎熒光產(chǎn)量；/用來表征光系統(tǒng)PS II的光化學效率，從而反映葉綠體功能的完整性。先將薺菜暗處理30 min，然后使用調(diào)制葉綠素熒光成像儀分別測定、，計算/。

1.3.8 相對電導率的測定

采用DDS-307電導儀測定電導率。稱取5 mm直徑薺菜圓片0.5 g，置于100 mL燒杯中，加入50 mL蒸餾水，于25 ℃靜置1 h后測定電導率/（μS/cm），然后進行沸水浴5 min，將燒杯中蒸餾水補齊至50 mL，冷卻后測定電導率/（μS/cm）。根據(jù)、的比值計算出相對電導率/%。

1.3.9 丙二醛和過氧化氫含量及超氧陰離子生成速率的測定

MDA含量參考文獻[16]并略作修改。稱取2.0 g樣品，加入5 mL 10%三氯乙酸溶液充分研磨，將所得勻漿離心（12 000×、20 min、4 ℃）。取上清液測定計算MDA含量，單位為nmol/g。過氧化氫含量的測定參考文獻[17]，單位為μmol/g。超氧陰離子生成速率的測定參考文獻[16]，單位為nmol/（min·g）。

1.3.10 ROS代謝相關酶活力的測定

SOD活力的測定參考文獻[18]并略作修改。以每分鐘反應體系在560 nm波長處對氮藍四唑光化還原的抑制率為50%時所需酶量為1 個活力單位U，單位為U/g。POD、CAT、APX活力的測定參考文獻[19]。分別以每分鐘各反應體系吸光度變化1為1 個酶活力單位（U），單位為U/g。

1.3.11 總酚和類黃酮含量的測定

總酚和類黃酮相對含量測定參考文獻[16]的方法并略作修改。最終結果分別表示為OD/g和OD/g。

1.3.12 ASA-GSH循環(huán)物質水平測定

ASA、氧化型抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DHA）以及GSH、氧化性谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）含量的測定參考文獻[20]并略作修改。ASA、DHA含量單位為mg/g，GSH、GSSG含量單位為μg/g。谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroanticyclic acid reductase，DHAR）活力的測定參考文獻[6]。GR、MDAR以每分鐘反應體系340 nm波長處吸光度變化1為1 個酶活力單位（U），DHAR以每分鐘265 nm波長處吸光度變化0.01為1 個酶活力單位（U）。以上結果單位均為U/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗設置3 個生物學重復，結果以平均值±標準差表示。采用Origin 2021軟件作圖，采用SPSS Statistics 21軟件進行單因素方差分析，采用檢驗進行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 褪黑素處理對薺菜葉片色澤、葉綠素含量的影響

色澤指數(shù)*值和分別代表薺菜葉片色澤的明亮度和色調(diào)，二者的變化可以反映薺菜貯藏期內(nèi)顏色的變化。圖1A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的均逐漸減小。第3天后處理薺菜顯著高于對照（＜0.05），貯藏18 d時，處理和對照薺菜的分別為123.41和117.22。圖1B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的*值均呈持續(xù)上升。第3天后處理薺菜*值顯著低于對照（＜0.05），貯藏18 d時，處理和對照薺菜的*值分別為50.35和54.71。以上結果表明褪黑素處理保持了貯藏期間薺菜的色澤，延緩了薺菜的黃化。

葉綠素的降解是引起薺菜葉片黃化的直接原因。圖1C顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的葉綠素含量均逐漸降低。從貯藏3 d開始處理薺菜葉綠素含量顯著高于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜葉綠素含量為對照的1.17 倍，表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜葉綠素的降解，延緩了組織的黃化。

圖1 褪黑素處理對薺菜葉片H（A）、L*值（B）、葉綠素含量（C）的影響Fig. 1 Effect of melatonin treatment on H (A), L* value (B) and chlorophyll content (C) in the leaves of Capsella bursa-pastoris

2.2 褪黑素處理對薺菜葉片中葉綠體結構和功能的影響

透射電子顯微鏡下薺菜葉片細胞的超微結構顯示，新鮮薺菜葉片中葉綠體數(shù)目較多被膜結構完整，呈梭形結構緊貼細胞壁分布，基粒片層結構排列緊密有序，含有少量嗜餓顆粒和淀粉粒（圖2）。從貯藏7 d開始，褪黑素處理和對照薺菜葉片細胞中葉綠體體積開始膨脹形狀發(fā)生卷曲，且與細胞壁之間的距離增大，基粒片層結構的有序性降低，嗜餓顆粒和淀粉粒數(shù)目增多。貯藏18 d時，褪黑素處理薺菜葉片細胞的超微結構與對照相比葉綠體膜和細胞膜仍保持較為完整的形態(tài)，基粒片層結構仍保持較為緊密有序的排列狀態(tài)。以上結果表明，褪黑素處理維持了貯藏期間薺菜葉片細胞中葉綠體結構的完整性。

圖2 褪黑素處理對薺菜葉綠體超微結構的影響Fig. 2 Effect of melatonin treatment on chloroplast ultrastructure in the leaves of Capsella bursa-pastorise

葉綠素熒光參數(shù)反映了植物對光能的吸收、傳遞和利用效率，可用來表征植物光合作用效率的高低。圖3A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的逐漸降低。第12天后處理薺菜顯著高于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜為對照的1.23 倍，表明褪黑素處理延緩了貯藏期間薺菜葉綠體PSII反應中心活力的降低，保持了葉綠體功能的完整性。圖3B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的/持續(xù)減小。第3天后褪黑素處理薺菜/高于對照，貯藏18 d時褪黑素處理薺菜/為對照的1.37 倍，表明褪黑素處理保持了貯藏期間薺菜葉綠體功能的完整性。

圖3 褪黑素處理對薺菜Fm（A）、Fv/Fm（B）的影響Fig. 3 Effect of melatonin treatment on Fm (A) and Fv/Fm ratio (B) of Capsella bursa-pastoris

2.3 褪黑素處理對薺菜呼吸速率和質量損失率的影響

呼吸速率的變化可反映果蔬在貯藏期間的衰老進程。圖4A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的呼吸速率呈先上升后下降的趨勢，第7天出現(xiàn)呼吸高峰。第7天后處理薺菜呼吸速率顯著低于對照（＜0.05），18 d時褪黑素處理薺菜呼吸速率低于對照17.3%，表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜的呼吸作用，減少了營養(yǎng)物質的消耗。

質量損失率可反映貯藏期間果蔬水分和營養(yǎng)物質的損失。圖4B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的質量損失率均逐漸增大。從貯藏第3天開始處理薺菜質量損失率顯著低于對照（＜0.05），表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜水分的流失。

圖4 褪黑素處理對薺菜呼吸速率（A）、質量損失率（B）的影響Fig. 4 Effect of melatonin treatment on respiration rate (A) and mass loss rate (B) of Capsella bursa-pastoris

2.4 褪黑素處理對薺菜葉片細胞相對電導率、MDA含量以及自由基含量的影響

相對電導率可反映細胞膜受損傷的程度。圖5A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的相對電導率持續(xù)上升。從貯藏第3天開始，褪黑素處理薺菜相對電導率顯著低于對照組（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜相對電導率較對照下降6.28%。以上結果表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜相對電導率的上升，減少了薺菜葉片細胞電解質的外滲，保持了薺菜葉片細胞膜的完整性。MDA含量是反映果蔬膜脂過氧化強弱和衰老程度的重要指標。圖5B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的MDA含量不斷上升。第3天后處理薺菜MDA含量顯著低于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜MDA含量比對照低27%，表明褪黑素處理減少了貯藏期間薺菜MDA的積累，抑制了薺菜細胞膜膜脂過氧化作用。

圖5C顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的超氧陰離子產(chǎn)生速率均連續(xù)增大。從貯藏第12天開始褪黑素處理薺菜超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著低于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜超氧陰離子產(chǎn)生速率比對照組17.3%；圖5D顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的HO含量持續(xù)增長。第3天后處理薺菜HO含量顯著低于對照（＜0.05），貯藏12 d時褪黑素處理薺菜HO含量較對照減少13.94%，表明褪黑素處理抑制了貯藏期間ROS的積累。

圖5 褪黑素處理對薺菜相對電導率（A）、MDA含量（B）、超氧陰離子產(chǎn)生速率（C）、H2O2含量（D）的影響Fig. 5 Effect of melatonin treatment on relative conductivity (A),malondialdehyde content (B), superoxide anion radical production rate(C) and H2O2 content (D) of Capsella bursa-pastoris

2.5 褪黑素處理對薺菜SOD、CAT、POD活力的影響

SOD、CAT、POD是果蔬體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的重要保護酶。圖6A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的SOD活力呈先上升后下降的趨勢。從貯藏7 d開始處理薺菜SOD活力顯著高于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜SOD活力為對照的1.33 倍。圖6B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的CAT活力呈先上升后下降的趨勢。從貯藏3 d開始處理薺菜CAT活力顯著高于對照（＜0.05），貯藏7 d時褪黑素處理薺菜CAT活力為對照的1.09 倍。圖6C顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的POD活力持續(xù)增強。從貯藏3 d開始處理薺菜POD活力顯著低于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜POD活力較對照下降9.76%。以上結果表明，褪黑素處理延緩了貯藏期間薺菜SOD、CAT活力的降低，抑制了貯藏期間薺菜POD活力的上升。

圖6 褪黑素處理對薺菜SOD（A）、CAT（B）、POD（C）活力的影響Fig. 6 Effect of melatonin treatment on the activities of SOD (A), CAT (B)and POD (C) in Capsella bursa-pastoris

2.6 褪黑素處理對薺菜APX、DHAR、MDAR、GR活力的影響

DHAR、GR、MDAR、APX是ASA-GSH循環(huán)中的關鍵酶，其活力對ASA、GSH的含量變化有重要影響。圖7A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的APX活力呈先上升后下降的趨勢。第7天后處理薺菜APX活力顯著高于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理組APX活力為對照的1.27 倍。圖7B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的DHAR活力持續(xù)降低。貯藏18 d時褪黑素處理薺菜的DHAR活力為對照的1.22 倍。圖7C顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的MDAR活力持續(xù)降低。從貯藏3 d開始褪黑素處理薺菜MDAR活力顯著高于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜MDAR活力為對照的1.13 倍。圖7D顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的GR活力呈先上升后下降的趨勢。從貯藏7 d開始褪黑素處理薺菜GR活力顯著高于對照（＜0.05），貯藏12 d時褪黑素處理GR活力為對照的1.18 倍。

圖7 褪黑素處理對薺菜APX（A）、DHAR（B）、MDAR（C）、GR（D）活力的影響Fig. 7 Effect of melatonin treatment on the activities of APX (A),DHAR (B), MDAR (C) and GR (D) in Capsella bursa-pastoris

2.7 褪黑素處理對薺菜抗氧化物質的影響

ASA、GSH、總酚、類黃酮是果蔬體內(nèi)非酶促防御系統(tǒng)的關鍵物質，其含量可反映果蔬抗氧化能力。

圖8A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的ASA含量均呈先上升后下降趨勢，貯藏第7天出現(xiàn)峰值。從貯藏第12天開始褪黑素處理薺菜ASA含量顯著高于對照（＜0.05），貯藏12 d和18 d時褪黑素處理薺菜ASA含量分別為對照的1.06 倍和1.18 倍。圖8B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的ASA/DHA（二者含量比值）總體逐漸下降。從貯藏3 d開始褪黑素處理薺菜ASA/DHA顯著高于對照（＜0.05），貯藏12 d時褪黑素處理薺菜ASA/DHA為對照的1.13 倍，表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜ASA的降解，提高了ASA的相對含量。圖8C顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的GSH含量持續(xù)上升。從貯藏第3天開始褪黑素處理薺菜DHA含量顯著高于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜GSH含量為對照組的2.23 倍，表明褪黑素處理增加了貯藏期間薺菜GSH含量。圖8D顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的GSH/GSSG（二者含量比值）明顯高于貯藏第0天。從貯藏第3天開始褪黑素處理薺菜GSH/GSSG顯著高于對照，貯藏18 d時褪黑素處理薺菜GSH/GSSG為對照的2.04 倍，表明褪黑素處理促進了GSH的產(chǎn)生，提高了GSH的相對含量。

圖8 褪黑素處理對薺菜ASA含量（A）、ASA/DHA（B）、GSH含量（C）、GSH/GSSG的影響Fig. 8 Effect of melatonin treatment on ASA (A), ASA/dehydroascorbic acid (B), GSH (C) and GSH/oxidized glutathione (D) contents of Capsella bursa-pastoris

圖9A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的總酚含量均持續(xù)減少。從貯藏第3天開始褪黑素處理薺菜總酚含量顯著高于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜總酚含量為對照的1.11 倍。這一結果表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜總酚的降解，維持了薺菜的抗氧化能力。圖9B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對照薺菜的類黃酮含量持續(xù)減少。從貯藏第3天開始褪黑素處理薺菜總酚含量顯著高于對照（＜0.05），貯藏18 d時褪黑素處理薺菜類黃酮含量為對照的1.06 倍，表明褪黑素處理抑制了貯藏期間類黃酮的降解，維持了貯藏期間薺菜的抗氧化能力。

圖9 褪黑素處理對薺菜總酚（A）、類黃酮（B）含量的影響Fig. 9 Effect of melatonin treatment on the contents of total phenols (A)and flavonoids (B) in Capsella bursa-pastoris

3 討 論

失水萎焉和葉片黃化是貯藏期間薺菜衰老最直觀的表現(xiàn)。薺菜采后有機養(yǎng)分持續(xù)供應終止，為維持體內(nèi)生理生化穩(wěn)態(tài)，延緩品質下降，需要通過呼吸作用來消耗機體內(nèi)剩余的有機養(yǎng)分。旺盛的呼吸作用會消耗大量的營養(yǎng)物質，同時伴隨大量水分流失，釋放呼吸熱，造成高溫環(huán)境，加速薺菜品質劣變。本研究結果表明，褪黑素處理能夠降低貯藏期間薺菜的呼吸速率同時抑制薺菜質量損失率的上升。這與褪黑素能夠提高薺菜機體的抗脅迫能力，從而提升機體對水分的利用效率、減少水分的散失有關。同時在呼吸作用過程的ROS可通過破壞葉綠素分子的四吡咯環(huán)結構、催化卟啉環(huán)氧化開環(huán)，將葉綠素由綠色漂白為白色，導致薺菜葉片黃化。本研究結果顯示，褪黑素處理有效抑制了貯藏期間薺菜葉綠素的降解，減輕了薺菜葉片的黃化，與褪黑素處理黃瓜和青花菜時的效果相似。這可能與褪黑素抑制了ROS對葉綠素的漂白作用有關。

植物中的ROS主要在光合作用與呼吸作用的電子傳遞鏈過程中產(chǎn)生，薺菜葉片中ROS的主要來源為葉綠體和線粒體。貯藏期間ROS作為呼吸作用的副產(chǎn)物不斷積累，ROS的過量積累會加速薺菜細胞膜脂過氧化進程，破壞細胞膜與葉綠體膜結構，從而促使葉綠體形狀卷曲和基粒片層結構松散，破壞葉綠體結構完整性。褪黑素作為一種自由基清除劑，可直接對ROS進行清除，從而減輕ROS對細胞造成的傷害。本研究結果表明，褪黑素處理能夠有效抑制貯藏期間薺菜超氧陰離子和HO的積累，降低MDA含量和相對電導率，延緩膜脂過氧化進程，從而保護細胞膜、葉綠體膜結構，抑制葉綠體形狀卷曲以及基粒片層結構的松散，維持葉綠體結構和功能的完整性。這與褪黑素處理桃果實的研究結果相似。

當果蔬內(nèi)ROS開始積累，會激活其氧化還原防御系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括酶促抗氧化體系和非酶抗氧化體系兩種。酶促抗氧化體系主要通過調(diào)節(jié)SOD、CAT、POD、APX等抗氧化酶的活力來清除ROS。本研究結果顯示，褪黑素處理提高了SOD、CAT、APX活力，SOD可將超氧陰離子特異性地歧化為HO和超氧陰離子；CAT則通過與SOD的協(xié)同作用將HO還原為HO；APX一方面將HO還原為HO和脫氫抗壞血酸；另一方面協(xié)助CAT以及酚類物質將HO還原成HO。此外，褪黑素處理還降低了POD活力，POD在將HO分解成HO的同時也能將多酚類物質氧化成醌類物質，醌類物質可反向歧化為鄰醌自由基，間接參與ROS生成，因此降低POD活力直接降低了酚類物質氧化的風險，間接減少了ROS的積累。褪黑素通過調(diào)節(jié)這一系列抗氧化酶的活力，有效抑制ROS的積累，提升了貯藏期內(nèi)薺菜的品質，延緩了薺菜的衰老。

非酶抗氧化體系主要通過ASA、GSH等抗氧化物質與ROS發(fā)生反應而達到清除目的。ASA和GSH是植物非酶抗氧化體系的重要成員，二者與GR、MDAR、DHAR、APX共同構成ASA-GSH循環(huán)，ASA-GSH循環(huán)對于ROS的清除具有重要作用，它一方面通過酶的催化作用直接清除植物細胞內(nèi)的HO；另一方面通過促進ASA和GSH兩種抗氧化劑的生成來提高植物細胞的抗氧化能力，特別是在CAT不足的情況下，果蔬中產(chǎn)生的HO主要是通過ASA-GSH循環(huán)清除的。ASA和GSH作為重要的抗氧化劑，其氧化還原的狀態(tài)可以反映植物細胞環(huán)境中的氧化水平，本實驗結果表明，褪黑素處理有效延緩了ASA和GSH的降解，從而提升了薺菜的抗氧化能力。這與褪黑素處理提高了APX、DHAR、MDAR和GR的活力密切相關，APX可以將植物細胞內(nèi)的HO清除生成HO，同時會將ASA氧化成DHA；DHAR和MDAR分別以DHA和MDHA為反應底物還原生成ASA，維持了ASA的還原狀態(tài)，同時DHAR還將GSH氧化成GSSG；GR利用NADPH提供電子，將GSSG還原為GSH，保證了GSH的高效再生。褪黑素處理通過調(diào)控ASA-GSH循環(huán)中各個關鍵酶的活力，使得該循環(huán)各環(huán)節(jié)高效運轉，提升了貯藏期間薺菜非酶促抗氧化體系的功能，進而提高了薺菜的抗氧化能力，推遲了薺菜的衰老進程，有利于薺菜貯藏期的延長。

綜上，本實驗結果表明，100 μmol/L褪黑素處理可以增強2 ℃貯藏期間薺菜抗氧化酶活力、保持較高抗氧化物質含量、抑制ROS的積累、維持葉綠體結構完整和功能完整性，達到抑制薺菜品質劣變和保持薺菜抗氧化能力的作用。