好氧混菌礦化能力與增強再生粗骨料性能研究

王玉珍， 孟慶玲， 許順順， 張家廣*， 周愛娟

(1.太原理工大學土木工程學院， 太原 030024； 2.太原理工大學環境科學與工程學院， 太原 030024)

微生物礦化沉積方法(microbially induced carbonate precipitation;，MICP)利用自然界一些礦化微生物所具有的碳酸鈣誘導沉積功能，沉淀物耐久性能良好且易附著膠結于砂漿和石子表面，可以有效的填充或黏結具有滲透性的有孔介質，從而實現改善材料的孔隙結構、修復混凝土材料微裂縫以及強化再生骨料等目的。MICP方法被越來越廣泛用于建筑材料領域中，主要包括磚石類古建筑的修復[1]、土體加固[2]、修復污染土[3]、自修復混凝土裂縫[4]、增強再生骨料[5-6]等。目前適用于裂縫自修復混凝土和增強再生骨料的礦化微生物主要包括3種類型：①產脲酶微生物利用脲酶水解尿素產生碳酸根離子，與鈣離子反應沉積碳酸鈣；②好氧微生物通過新陳代謝的呼吸作用轉化營養物質為碳酸鈣；③硝酸鹽還原菌的反硝化作用可以在缺氧環境下將有機碳轉化成碳酸根離子，從而生成碳酸鈣沉淀[7-9]。

目前學者針對MICP方法增強再生骨料物理力學性能進行了較多的試驗研究。Grabiec等[10]驗證了巴氏芽孢桿菌礦化沉積可以有效地降低再生骨料吸水率，MICP技術對再生骨料性能提高具有積極作用。朱亞光等[11]使用嗜堿芽孢桿菌H4和假堅強芽孢桿菌礦化改性再生骨料，嗜堿芽孢桿菌H4效果更好，礦化產物中碳酸鈣含量更高，通過控制菌液濃度、溫度、礦化時間可以有效提高礦化效率及再生骨料改性效果，且礦化系數、微生物自身礦化效果、對骨料礦化效果三者成正相關。Zhu等[12]基于好氧菌嗜堿芽孢桿菌H4誘導碳酸鈣沉淀增強再生砂漿骨料，試驗發現將骨料置于容器中部，并向含有細菌的培養液中添加氧氣釋放化合物，骨料浸泡20 d后其吸水率和破碎指數分別降低了40.38%和19.76%。Liu等[13]利用反硝化細菌對再生骨料改性進行試驗，浸泡處理后再生骨料較原始骨料吸水率和壓碎值分別降低14%和10%，表觀密度提高4%。Liu等[14]采用巨大芽孢桿菌對透水混凝土中的再生粗骨料浸泡處理，骨料在含細菌和鈣源及營養物質的培養基中浸泡21 d后，吸水率下降10.41%，制配的透水混凝土試塊抗壓強度提高28.48%。Zhan等[15]等通過巴氏芽孢桿菌強化再生細骨料，研究發現鈣源不同對骨料的強化效果也不同，且氯化鈣較硝酸鈣效果更佳，處理后的再生細骨料吸水率和壓碎值分別降低了40%和33%。Feng等[16]研究了pH、溫度、細菌濃度和鈣離子濃度對巴氏芽孢桿菌誘導沉淀量的影響，首先確定礦化條件，將再生細骨料浸泡于菌液與培養液的混合溶液中24 h，然后浸于沉淀培養液中，其吸水率降低，質量增加，且改性時間為7 d時最高效；在各類微生物中，產脲酶微生物礦化效率較高但水解尿素的過程中會釋放氨氣，因此對于好氧微生物等環境友好類的礦化微生物的研究也是十分必要的。此外，Qian等[17]研究了膠質芽孢桿菌的礦化，其固定空氣中的二氧化碳產生碳酸鹽和碳酸氫鹽，進一步礦化用于水泥基材料的裂縫愈合，這種微生物也具備環境友好這一特性。微生物礦化沉積碳酸鈣的過程受多種因素影響，提高微生物礦化效率滿足環境友好和經濟適用的要求有利于MICP技術更好地應用于實踐中。

然而當前大多數學者所采用的礦化微生物為單一類型的微生物(純菌)，純菌礦化過程需要適宜的環境條件，抵御環境變化的魯棒性可能不足，并且純菌培養需要嚴格的無菌環境，其培養費用較高。與純菌相比，多種礦化微生物組成的微生物群(混菌)對環境條件有更好的適應能力，其礦化效率更高，培養費用僅為純菌的1/3左右[18-19]。

1 試驗概況

1.1 混菌的篩選與培養

以山西省晉中市污水處理廠活性污泥和花園土壤為微生物源，在好氧條件下分別以乳酸、葡萄糖、蔗糖、木糖4種底物為碳源，制備不同的選擇培養液，進行連續傳代富集，好氧混菌的富集方法為：150 mL的錐形瓶中分別加入10 mL污泥混合液和100 mL好氧型選擇培養液，用Na3PO4調pH至11，用耐高溫組培封口膜覆蓋瓶口，在33 ℃恒溫振蕩培養箱中培養2 d；后將上清液去除取下底部的污泥混合溶液在相同操作下進行連續傳代富集，每隔一個周期(2 d)重復上述操作，直至篩選出目標菌群。混菌的礦化能力可由式(1)中的無機碳轉化率(IC-CR)來表征，無機碳轉化率越高則表明混菌的礦化能力越強。

(1)

式(1)中：ICt為時間t的無機碳濃度；IC0為選擇培養液中的初始無機碳濃度；TOC0為選擇培養液中的初始總有機碳濃度。

采用液體培養基對篩選的混菌進行大量培養，培養基配比為：每升超純水中加入胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g。菌液pH調節至7.0，在搖床中5 000 r/min轉速下離心20 min得到菌泥，使用滅菌后的酵母浸粉溶液(5 g/L)重懸，獲得一定OD600值的菌液。然后將菌液與營養液各50 mL加入150 mL的錐形瓶，置于恒溫搖床，在溫度為33 ℃，轉速160 r/min的條件下進行微生物礦化反應，培養到一定時間后對瓶中液體進行離心，用超純水將離心后的沉淀轉移到燒杯中，最后放入105 ℃烘箱中烘干，稱量沉淀物質量M，將其作為微生物礦化能力的評判標準。

1.2 不同環境條件下混菌礦化效率

為了考察不同環境條件對混菌礦化能力的影響，分別考察礦化時間、鈣離子濃度、乳酸濃度、菌液濃度和不同鈣源對混菌礦化效率的影響。并且在相同環境條件下將好氧嗜堿混菌礦化效率與好氧純菌科氏芽孢桿菌進行對比，以考察混菌對比純菌的礦化效率提升幅度。

1.2.1 礦化時間

分別采用表1所示的3組營養物質溶液，對混菌進行培養，培養時間設置為6～216 h，培養完成后對沉淀物進行離心和烘干處理，并稱量其質量，以考察不同礦化時間對不同營養物質時的混菌礦化能力的影響規律。

表1 營養物質配比Table 1 Proportion of nutrients

1.2.2 鈣離子濃度

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研究表明，隨著鈣離子濃度的逐步提高，微生物礦化效率呈現出先提高后降低的變化規律。為了考察鈣離子濃度對混菌礦化效率的影響規律，以確定最優的鈣離子濃度，設計6個試驗組，鈣離子濃度分別配制為0、5、25、45、65、85 g/L，乳酸濃度均為45 g/L,分別測試礦化時間為3 d和7 d時的沉淀物質量。

1.2.3 乳酸濃度

乳酸可作為混菌礦化的營養物質，保持鈣離子濃度為65 g/L，將 UMB-2和UMB-3組的乳酸濃度分別配制為0、5、25、45、65、85 g/L，對混菌進行培養7 d，考察不同乳酸濃度對混菌礦化效率的影響，以確定出最優的乳酸濃度。

1.2.4 菌液濃度

為了考察不同菌液濃度對混菌礦化效率的影響，將菌液OD600值分別配制為0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8，對混菌進行培養7 d。各測試組均采用測試得到的最優營養物質與鈣離子濃度：UMB-1組乳酸鈣濃度65 g/L；UMB-2組硝酸鈣濃度65 g/L，乳酸濃度65 g/L；UMB-3組乳酸濃度45 g/L，硝酸鈣濃度32.5 g/L，乳酸鈣濃度32.5 g/L。

1.2.5 不同礦化微生物

將相同環境條件下好氧混菌與科氏芽胞桿菌的礦化效率進行對比，以考察混菌對比純菌的礦化效率提升效果。設置2個測試組，其中AMB測試組礦化微生物采用本文篩選的好氧混菌，PBC測試組菌采用科氏芽孢桿菌。測試組的菌液OD600為1.0，營養物質配比為乳酸45 g/L，硝酸鈣32.5 g/L，乳酸鈣32.5 g/L，分別測試礦化時間為3 d和7 d時的沉淀物質量。

1.3 再生粗骨料礦化增強處理

采用最優配比參數的混菌和營養物質對再生骨料進行礦化增強處理，以驗證本文篩選好氧混菌增強再生骨料物理力學性能的有效性。所采用的再生粗骨料購買自河北邯鄲某再生骨料廠，粒徑為5～20 mm。再生骨料礦化增強過程為：采用OD600=1.4的混菌溶液，用2 mol/L的NaOH溶液調節pH為9.0；再生骨料采用真空吸附法吸附混菌，即菌液在-0.06 MPa的氣壓下保持20 min吸附于再生粗骨料表面，5 d為一個周期共吸附兩次，然后將吸附混菌的再生骨料在40 ℃環境下烘干至橫重，最后放入玻璃器皿中加入65 g/L的乳酸鈣溶液礦化增強處理一定時間后取出。為了保持增強處理過程中溶液氧氣濃度恒定，采用氧氣泵不間斷向溶液中通入氧氣，并且環境溫度控制為33 ℃。增強處理完畢后，將再生骨料取出放入烘箱105 ℃烘干至恒重，并依據《建筑用卵石、碎石》(GB/T 14685—2011)分別測試不同增強時間下再生骨料的質量增加率、表觀密度、吸水率和壓碎指標。

2 試驗結果與分析

2.1 混菌無機碳轉化率

富集馴化完成后及時測試混菌的無機碳轉化率和選擇培養液pH。試驗結果表明，篩選的好氧嗜堿混菌的無機碳轉化率隨著富集馴化次數的增加，表現出先升高后降低的變化趨勢，最優富集馴化為12次。經富集馴化12次后，4種碳源對應的混菌IC轉化率和選擇培養液pH隨時間的變化規律如圖1所示。從圖1中可以看出，以乳酸為碳源篩選的好氧嗜堿混菌無機碳轉化率達到最高，是其他3組的1.52～2.08倍，且選擇培養液pH隨著時間延長降低幅度小于其他3組，其值從11降低至8.9，表明以乳酸為碳源富集馴化的混菌合成碳酸鹽的能力最強。因此，選取以乳酸為碳源、經富集馴化12次后篩選的好氧混菌為礦化微生物。

圖1 不同碳源下混菌的IC轉化率和選擇培養液pHFig.1 IC conversion rate of mixed cultures and pH value of culture solution using different substrate

2.2 礦化時間對混菌礦化效率的影響

不同營養物質下混菌經礦化反應7 d后生成的礦化沉淀物如圖2所示，圖2中的對照組僅采用營養物質溶液。從圖2中可以看出，除對照組外各測試組經礦化反應7 d后瓶底均有沉淀物生成，表明本文篩選的好氧混菌具有良好的將鈣源和營養物質轉化為礦物沉淀能力。圖3為UMB-1、UMB-2和UMB-3測試組在不同礦化時間下的混菌礦化沉淀量，從圖3中可以看出，隨著礦化沉積時間的延長，礦化沉淀量呈現出先逐漸增大后趨于穩定的變化規律；UMB-1組與UMB-3組在礦化沉積時間為6～72 h時，沉淀量增大幅度較小，超過72 h之后沉淀量增大幅度提高；UMB-2組隨著礦化時間的延長，沉淀量呈現出線性增大趨勢，使得一段時間后晶體質量趨于穩定；相同礦化時間下，UMB-2測試組的混菌礦化效率最高。此外，經168 h的礦化反應后，3個測試組的混菌礦化沉淀量均趨于穩定,原因可能為：隨著礦化時間進一步延長，礦化沉淀物量大幅度增大，這些沉淀會逐漸把混菌包裹，致使與營養物質直接接觸的混菌數量逐漸減少，從而導致混菌的礦化效率出現降低。

圖2 不同營養物質下混菌的礦化沉淀物Fig.2 Mineralization ofmixed cultures using different nutrients

圖3 礦化時間對混菌礦化效率的影響Fig.3 Effect of culture time on mineralization of mixed cultures

圖4 鈣離子濃度對混菌礦化效率的影響Fig.4 Effect of Ca2+ concentration on mineralization of mixed cultures

2.3 鈣離子濃度對混菌礦化效率的影響

鈣離子濃度對不同營養物質下混菌礦化沉淀量的影響如圖4所示。從圖4中可以看出，隨著鈣離子濃度逐漸增大，各測試組混菌沉淀量均呈現先增大后降低的趨勢，當鈣離子濃度為65 g/L時，3個測試組經3 d和7 d礦化反應的混菌沉淀量均達到最大，當鈣離子濃度超過65 g/L時，各測試組礦化沉淀量均出現一定程度的下降；相同鈣離子濃度下，UMB-3組的混菌礦化效率最高，3 d時和7 d時最大沉淀量分別達到1.01 g和1.2 g。上述試驗結果表明，在一定范圍內提高鈣離子濃度能夠有效提高混菌的礦化效率，但當鈣離子超過一定濃度時，較高濃度的鈣離子反而會抑制混菌的礦化效率，因此微生物礦化需選擇合理的鈣離子濃度。

2.4 乳酸濃度對混菌礦化效率的影響

圖5 乳酸濃度對混菌礦化效率的影響Fig.5 Effect of lactic acid concentration on mineralization of mixed cultures

乳酸濃度對不同營養物質下混菌礦化效率的影響如圖5所示，從圖5中可以看出，隨著乳酸濃度的增大，礦化沉淀量呈現出先增大后趨于穩定的變化規律；由于UMB-3組營養物質由乳酸和乳酸鈣組成，其前期礦化反應速率較快，能夠生成更多的礦化沉淀，其礦化效率比UMB-2更高；UMB-2和UMB-3組的最優乳酸濃度分別為65 g/L和45 g/L，相應的最大礦化沉淀量分別為0.94 g和1.2 g，菌液濃度一定時，混菌的分解營養物質的能力有限；當溶液中乳酸的濃度超過一定值時，混菌礦化沉積出的晶體質量趨于穩定，高濃度的乳酸不會明顯抑制混菌的礦化反應。

2.5 菌液濃度對混菌沉積效率的影響

圖6為菌液濃度對不同營養物質下混菌礦化效率的影響，從圖6中可以看出，隨著菌液OD600的增大，各測試組混菌的礦化沉淀量逐漸增大；相同菌液濃度下，UMB-3組混菌呈現出最高的礦化效率；當菌液OD600<0.2時，3個測試組混菌礦化效率均較快，當菌液OD600>0.2時，各測試組混菌礦化效率增長變緩。上述試驗結果表明，菌液濃度越大，混菌的礦化效率越高。

圖6 菌液濃度對營養物質礦化沉積量的影響Fig.6 The influence of bacterial liquid concentration on the amount of nutrient mineralization and deposition

2.6 不同礦化微生物礦化效率比較

礦化反應3 d和7 d時不同類型礦化微生物的礦化沉淀量如圖7所示。從圖7可以看出，PBC與AMB測試組礦化反應7 d時的沉淀量明顯高于3 d沉淀量；相同礦化反應時間下，好氧嗜堿混菌的礦化沉淀量均顯著大于科氏芽孢桿菌，礦化反應3 d和7 d時AMB組的礦化沉淀量分別為PBC組的1.11倍和1.08倍。上述試驗結果表明，本文篩選的好氧混菌能夠呈現出比好氧純菌更強的礦化沉積能力。其原因可能為：與純菌相比，混菌由不同菌落組成，其抗環境沖擊能力更強，并且混菌的菌落之間能夠相互交換代謝物或傳遞分子信號，使得混菌能夠承擔更多或者更復雜的任務，上述優勢使得混菌的礦化魯棒性更強，并且能夠呈現出效率更高和穩定性更強的礦化沉積能力。

圖7 不同礦化微生物礦化效率比較圖Fig.7 Mineralization comparison of different bacteria

2.7 再生粗骨料的礦化增強效果分析

圖8為不同混菌礦化增強時間對再生混凝土粗骨料物理力學性能的影響。從圖8中可以看出，隨著礦化增強時間的延長，再生骨料的質量增長率和表觀密度逐漸提高；經過15 d礦化增強后，再生骨料的質量增長率達到2.5%，表觀密度達到2 641 kg/m3，與未增強再生骨料相比提高了2.52%；隨著礦化增強時間的延長，再生骨料的吸水率和壓碎指標不斷降低，當增強時間達到15 d時，再生骨料的吸水率和壓碎指標達到最低值，分別為4.1%和11.2%，與未增強再生骨料相比降低幅度分別達到44.6%和30%。上述試驗結果表明，篩選的混菌能夠有效地修復再生粗骨料的表面缺陷，進而增強再生粗骨料的物理力學性能，延長混菌礦化增強時間能夠顯著地改善再生骨料物理力學性能增強效果。

圖8 增強時間對再生粗骨料物理力學性能影響Fig.8 Effect of enhanced time on physical and mechanical properties of recycled aggregate

2.8 微觀結構與物相分析

圖9(a)為好氧混菌礦化沉淀物在放大3 000倍后的晶體掃描電子顯微鏡(SEM)微觀圖，從圖9(a)中可以看出，混菌礦化沉淀物形狀均為規則塊狀，由菱形狀的晶體相互連接、相互結合成大的晶體團構成。圖9(b)為經好氧混菌礦化增強后的再生粗骨料表面微觀圖，從圖中可以看出，經過混菌礦化增強處理后的再生骨料表面生成一層碳酸鈣沉淀，沉淀物較密實、均勻地附著在骨料表面，并且將舊砂漿與微裂縫有效包裹，在宏觀角度表現為骨料的表觀密度提高、吸水率與壓碎指標降低等現象，從而實現增強再生骨料物理力學性能的目的。

圖9 混菌礦化沉淀物和再生骨料表面SEM圖Fig.9 SEM images of mixed cultures mineralization and surfaces of recycled aggregate

圖10 混菌礦化沉淀物XRD分析圖Fig.10 XRD analysis of mixed cultures mineralization

圖10為混菌礦化增強再生骨料表面沉淀物的X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)圖譜。從圖10中可以看出，衍射譜在2θ=29.4°處出現了明顯強峰，這與Herrington[20]得到的純方解石強峰吻合良好，同時該礦化沉淀物其他峰值所對應的2θ與純方解石型晶體的峰值有較高的匹配度。上述試驗結果表明，混菌礦化增強再生粗骨料過程中生成的碳酸鈣晶體類型為穩定的方解石。

3 結論

篩選了一種適用于增強再生混凝土骨料性能的好氧混菌，考察了不同環境因素對好氧混菌礦化效率影響規律及其對再生粗骨料物理力學性能增強效果，得到如下主要結論。

(1)相同環境條件下，篩選的好氧嗜堿混菌的礦化效果優于好氧純菌，礦化反應7 d后混菌的沉淀量達到純菌的1.08倍，其礦化沉淀物形狀均為規則塊狀，由菱形狀的晶體相互連接、相互結合成大的晶體團構成。

(2)不同環境因素對混菌礦化效應影響顯著，隨著礦化沉積時間的延長，礦化沉淀量呈現出先逐漸增大后趨于穩定的變化規律；菌液濃度越大，混菌的礦化效率越高；過高濃度的鈣離子反而會抑制混菌的礦化效率。

(3)好氧混菌能夠有效地增強再生粗骨料物理力學性能，礦化增強15 d后，沉淀物較密實、均勻地附著在骨料表面，并且將骨料表面舊砂漿與微裂縫有效包裹，再生粗骨料質量增長率和表觀密度提高幅度分別達到2.9%和3.1%，吸水率和壓碎指標分別降低44.6%和30%。