小針刀療法對類風濕性關節炎大鼠TNF-α及lL-6的影響

洪志評，張 蕓，李泰標，鄭丁炤，吳心虹

（廈門市第五醫院，福建 廈門 361101）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種慢性全身性自身免疫病，主要病理變化為炎性滑膜炎。病變侵犯全身多個關節，以手、足小關節起病多見，具有多關節、對稱性、關節外病變的特點，也可侵犯其他系統變生他病。晚期關節可出現不同程度的僵硬畸形，影響人們的日常生活。RA 的病因尚未完全明確，病理機制亦尚未完全闡明，多種源自免疫系統和滑膜組織的細胞及其分泌的細胞因子參與了疾病的發展。目前治療上多使用非甾體類抗炎藥（NSAIDS）、抗風濕藥物、生物制劑等，但長期用藥易導致嚴重的胃腸道癥狀和肝、腎方面的損傷[1]。

小針刀近年來發展迅速，臨床實踐表明通過針刀系統治療可改善類風濕性關節炎患者的癥狀，提高生活質量[2-3]。小針刀療法在臨床中除了改善局部關節的變性組織，通過松解迷走神經走行中周圍的粘連、攣縮、堵塞，改善局部供血，調控神經平衡，達到治療類風濕性關節炎的作用，但缺乏有效的理論依據。本文通過觀察小針刀療法松解迷走神經周圍組織對RA 的治療作用，進一步研究小針刀療法治療RA的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF 級SD 大鼠共30 只（體重180～220g），雌雄各半，由廈門大學實驗動物中心提供（許可證號：SYXK(閩)2013-0006）。

1.1.2 主要試劑TNF-α ELISA 試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；IL-6 ELISA 試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；RNA 提取試劑盒（Promega，型號：LS1040）；逆轉錄試劑盒（Promega，型號：A5001）；QPCR 熒光染料（全式金，型號：AQ101-03）。

1.1.3 主要儀器SYL-2-6 恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；Stepone Plus 熒光定量PCR儀（ABI）；H2500R-2 高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；MULTI-SKAN FC 酶標儀（賽默飛）。

1.2 研究方法

1.2.1 造模及分組SD 大鼠30 只，雌雄各半，分為三組，即正常組（C）、模型組（N）、針刀組（M），每組10 只，除對照組10 只注射0.1mL 生理鹽水外，其余各鼠用體積分數為5%水合氯醛（按100g 體質量注射0.8mL）腹腔麻醉后，于大鼠左后足跖底部常規皮膚消毒后，拉直大鼠左側后肢，用1mL微量注射器皮內進針至左后足跖，注射完全弗氏佐劑0.1mL 致炎，注射前用75%乙醇輕拭注射部位，造模7天后檢測RF 陽性，證明造模成功，隨機分為模型組、針刀組各10只。

1.2.2 干預方法 對照組、模型組不予特殊處理；針刀組：常規備皮、消毒，選用一次性針刀，規格0.4mm×40mm，進針時刀口線與大鼠身體縱軸平行，刀體與皮膚切面垂直刺入，針刺至莖突前緣、莖突尖、頸1～頸7 后結節，當刀刃接觸骨面時，縱行剝離2次，每周2次，共4周。

1.2.3 動物處理 采用10%水合氯醛（0.3mL/kg）腹腔注射麻醉后，開腹開胸，取腎臟，處死前腹主動脈采血3mL，離心抽取血清，-20°C冰箱保存。

1.2.4 ELISA 實驗 各組TNF-α、IL-6 測定的操作步驟嚴格按照試劑盒說明書執行，見圖1（以檢測IL-6為例）。

圖1 ELlSA實驗步驟

1.2.5 QPCR 實驗 取滑膜組織在研缽中加液氮充分研磨，依照RNA 提取試劑盒（Promega）方法提取總RNA，依照逆轉錄試劑盒（Promega）方法逆轉錄為cDNA，使用ABI Stepone plus 儀進行熒光擴增，GAPDH 作為內參照反應程序。反應擴增條件：95℃30s、95℃5s、60℃30s、72℃1min，共45 個循環。檢測基因序列詳見表1；根據采用2-ΔΔCt公式計算目的基因的相對表達量，以正常組mRNA 的表達量作為“1”，再根據校正值計算出模型組及針刀組TNF-α、IL-6 mRNA相對含量。

表1 引物序列表

1.3 評價指標

1.3.1 觀察項目 致炎前及干預4周后檢測大鼠左后足爪腫脹評分及關節炎指數評分。（1）關節炎評分：無關節紅腫記0 分，趾關節紅腫記1 分，趾關節和足跖腫脹記2分，踝關節以下足爪腫脹記3分，踝關節在內的全部足爪腫脹記4分；每個關節最高為4分，4個關節累計積分即為每只大鼠的關節炎指數評分。（2）足爪腫脹評分：RA 模型大鼠每只足爪包括5 只指關節或趾關節、1 只腕關節或踝關節，每個小關節出現結節和紅腫記為1分。

1.3.2 檢測項目ELISA 法測定血清中TNF-α、IL-6含量；熒光定量PCR實驗檢測滑膜中TNF-α、IL-6 mRNA表達水平。

1.4 統計方法 采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。計量資料以均值加減標準差（±s）表示，多組間及治療前后比較采用單因素方差分析（One‐way ANOVA），組間兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett′s T3檢驗；無序計數資料以頻數（f）、構成比（P）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫脹及關節炎情況 與正常組比較，模型組后足爪腫脹評分及關節炎指數評分增加（P＜0.01），提示造模成功，見圖2；與模型組比較，針刀組左后足爪腫脹評分及關節炎指數評分減小（P＜0.05），詳見表2。

圖2 正常組及模型組大鼠左后足趾腫脹情況大體照片

表3 各組大鼠左后足爪腫脹評分及關節炎指數評分比較（± s，n=10）

表3 各組大鼠左后足爪腫脹評分及關節炎指數評分比較（± s，n=10）

注：與正常組比較，⑴P＜0.01；與治療前比較，②P＜0.05；與模型組比較，③P＜0.05

組別正常組模型組針刀組例數10 10 10時間治療前治療后治療前治療后治療前治療后足爪腫脹評分關節炎評分00 00 3.21±0.52⑴3.35±0.46⑴3.18±0.57⑴2.05±0.33⑴②③5.14±0.38⑴4.98±0.53⑴5.28±0.42⑴3.69±0.66⑴②③

2.2 血清指標 模型組TNF-α 較正常組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），模型組IL-6 雖較正常組升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），可能與實驗大鼠數量較少有關；針刀組血清TNF-α、IL-6水平較模型組降低（P＜0.05），見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠血清TNF-α表達情況

圖4 各組大鼠血清lL-6表達情況

2.3 滑膜QPCR 模型組及針刀組滑膜組織TNF-α、IL-6 mRNA 表達水平較正常組升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；針刀組TNF-α、IL-6 mRNA 表達較模型組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖5、圖6。

圖5 各組大滑膜中TNF-α mRNA表達情況

圖6 各組大滑膜中lL-6 mRNA表達情況

3 討論

近年來，炎癥因子網絡持續的激活/調節異常與自身抗原刺激的免疫反應，成為類風濕性關節炎慢性炎癥存在的主要原因[4]。目前認為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α,TNF-α）、IL-6、IL-17直接參與了類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis,RA）關節及關節軟骨的炎癥及破壞。本實驗中，模型組左后足趾明顯紅腫，血清及滑膜中TNF-α、IL-6 均較正常組升高，說明造模成果，支持此觀點。

基于炎癥因子學說，采用抑制體內促炎因子的多種途徑成為尋找RA 治療策略的主要方法。研究發現，中樞神經系統與免疫系統之間具有一條通路可以拮抗炎癥反應，即膽堿能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway），其是由迷走神經及其遞質乙酰膽堿和膽堿能受體所構成[5]。當迷走神經受刺激時，神經信號傳遞首先到腹部，接著通過第二條神經進入脾臟[6-7]，隨后釋放一種去甲腎上腺素神經遞質[8]，這個神經遞質可以直接與脾臟中的免疫T 細胞“交流”，刺激免疫T細胞釋放另一種神經遞質乙酰膽堿與脾臟中的巨噬細胞結合，進而阻止巨噬細胞產生炎癥蛋白。《Nature》發表的評論文章報道，通過對8 名類風濕關節炎患者電流刺激迷走神經每天4次，6周后發現其癥狀明顯改善，炎癥細胞因子（TNF-α和IL-6）顯著下降[9]。大量動物實驗結果亦表明，刺激迷走神經和使用膽堿能激動劑在急性全身性炎癥中可抑制TNF-α、IL-1、IL-6、HMGB1 等炎癥因子的生成和釋放，抑制NF-κB 信號通路，發揮抗炎作用[5]。因此，針對迷走神經的刺激有望成為治療自身免疫性疾病較好的方法。

小針刀療法在類風濕性關節炎方面具有獨特療效。根據臨床報道，小針刀可以調整機體免疫功能，改善血液流變學和微循環，對粘連、瘢痕、攣縮或鈣化等變性組織有切割作用，對應力性纖維組織和病變膨脹的滑囊，可使滑液溢出，也可起到減張作用[10]。針刀治療RA 的方法各有不同，但大部分以各大小關節的關節囊及關節周圍軟組織為治療點[11]。本實驗通過松解大鼠莖突前緣、莖突尖、頸1～頸7 后結節，松解迷走神經走形中的粘連、攣縮，刺激迷走神經，結果顯示針刀組血清TNF-α、IL-6 水平較模型組降低（P＜0.05），針刀組TNF-α、IL-6 mRNA 表達較模型組顯著降低（P＜0.01）。由此可見，小針刀刺激迷走神經具有調控神經平衡、抑制炎癥因子釋放的作用，從而治療類風濕性關節炎。上述的《Nature》文章作者在后續報道中提及在迷走神經刺激暫停14 天后，炎癥細胞因子又出現了一定程度的增加[12]，故小針刀的遠期療效還有待進一步研究。

綜上所述，本實驗通過對足爪大體情況及基因、蛋白水平檢測血清與滑膜中的典型炎癥因子，初步探討了小針刀療法治療類風濕性關節炎的可能作用機制：小針刀通過刺激迷走神經，能有效降低血清中TNF-α、IL-6水平，并下調滑膜組織中TNF-α、IL-6 mRNA的表達，減輕滑膜炎癥反應，故小針刀療法可能成為治療類風濕性關節炎較好的方法之一。