miR-134在腦卒中后認知障礙患者血清中表達及意義

趙嘉培，洪志評，劉 輝，張軍能，黃賽娥

（1.廈門市第五醫院，福建 廈門 361101；2.福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州 350001）

認知功能障礙是腦卒中常見的后遺癥，不但阻礙患者的全面康復，而且嚴重地影響其日常生活活動、社會參與、重返職場等[1]。腦卒中患者的早期認知診斷對幫助醫生識別那些存在高風險并可能繼續發展的腦卒中認知功能障礙（poststroke cognitive impairment, PSCI）具有很重要的臨床意義的[2]。近年來，血清microRNAs（miRNAs）作為生物學標志物在神經系統認知疾病中的作用逐漸受到關注。在阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）的研究過程中，Nimmi 等人首次證明了miR-134 介導的CREB-1 和腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）的轉錄后調控是該病可塑性缺陷的重要分子機制，提示miR-134-5p 作為AD 患者恢復可塑性的潛在治療靶點作用[3]。BDNF 是與突觸可塑性和記憶形成有關的重要的可塑性相關蛋白之一，海馬突觸可塑性在很大程度上依賴于BDNF 的可用性[4]。近年來的研究發現[5]，豐富的環境可以通過激活海馬SIRT1/miR-134 通路并上調下游BDNF 的表達來逆轉認知缺陷。因此，本研究的主要目的在于檢測miR-134及其下游靶基因BDNF 在PSCI 患者血清樣本中是否發生有意義的變化。為驗證這個假設，本研究招募了來自PSCI、腦卒中后認知功能正常（post-stroke cognitive normality, PSCN）及年齡匹配對照組（agematched controls,AMC）患者的血液樣本，并通過實時熒光定量PCR（Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR）技術來檢測miR-134 的相對表達水平，酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）技術來檢測BDNF 表達水平，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 病例來源 本研究通過了廈門市第五醫院倫理委員會的批準（倫理委員會批準文號：2017-XMSDWYY-012），受試者均簽署了知情同意書。研究招募來自廈門市第五醫院康復醫學科的56名腦卒中患者（其中認知功能正常組29 例，認知障礙組27 例）以及28 名非神經系統患者作為對照組被試。所有納入被試年齡為55-80 歲，且腦卒中患者和對照組被試的年齡、性別、受教育程度相匹配。

1.2 腦卒中后認知功能障礙組（PSCI）納入與排除標準 納入標準：①本人或法定監護人同意并已簽署知情同意書；②首次腦卒中，符合《中國各類主要腦血管病診斷要點2019》[6]中“腦卒中”的診斷標準，病程≤1 年；③蒙特利爾認知評估量表（Montreal Cognitive Assessment,MoCA）＜26 分；④病情穩定，意識清醒，生命體征穩定。排除標準：①經檢查證實有腦腫瘤、腦外傷、腦寄生蟲病等可引起認知功能障礙的其他疾病者；②存在嚴重言語、視力、聽力障礙或精神障礙等影響認知檢查者；③經既往病歷或臨床醫生或家屬證實其之前已經患有認知障礙的相關疾病或在發病前有使用針對認知障礙的藥物；④貝克抑郁量表（Beck Depression Inventory,BDI）＞13 分；⑤有酒精、藥物濫用史；⑥合并有嚴重的心、肝、腎、內分泌系統和造血系統等疾病者；⑦妊娠及哺乳期女性；⑧正在參加影響本研究結果評價的其它臨床試驗者。

1.3 卒中后認知功能正常組（PSCN）納入與排除標準 納入標準：①為同期住院缺血性腦卒中患者；②蒙特利爾認知評估量表（MoCA）≥26 分；③其余條目皆與卒中后認知功能障礙組相一致。排除標準：與卒中后認知功能障礙組一致。

1.4 對照組（AMC）納入標準 納入標準：①來自本院同期科室內非神經系統疾病患者；②無認知功能減退的主訴；③總體認知功能正常，MoCA篩查評分≥26。排除標準：①排除癡呆、腦血管病及其他存在或可引起認知功能障礙的中樞神經系統疾病；②存在嚴重言語、視力、聽力障礙或精神障礙等影響認知檢查者；③其余與卒中后認知功能障礙組后五條一致。

1.5 檢測方法 收集腦卒中患者和對照組全血，樣本為患者入院后首次采集的血液，于清晨空腹采取外周肘正中靜脈血4ml，置于無添加劑普通采血管中，3 小時內在室溫下3000rpm 離心5min 去除血細胞并收集上層血清，然后將收集的上層血清在4°C 條件下，13000rpm 離心5inin,進一步去除殘留的血細胞，離心后收集血清置于-80°C 冰箱保存待用。排除溶血的樣本或血清量少的等不合格樣本。

1.5.1 核酸提取與逆轉錄 采用北京康為世紀生物科技有限公司miRNA 提取試劑盒（型號：CW0627）進行miRNAs 提取，操作步驟嚴格按說明說執行。miRNAs 濃度及純度檢測采用德國Thermo 公司NanoDrop 2000c 分光光度計。本研究miRNA 濃度范圍：50-102 ng/l；miRNA 純度范圍：A260/A280比值：1.81-2.02。逆轉錄采用南京諾唯贊生物科技有限公司的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（型號：R222-01），實驗過程按說明書步驟進行。

1.5.2 RT-qPCR 實時檢測microRNAs采用南京諾唯贊生物科技有限公司的ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Low ROX Premixed）（型 號：Q431-02）。實驗過程按說明書步驟進行。用U6作為內部參考，然后使用2-ΔΔCt方法計算miR-134的相對表達。內參基因和目的基因引物由博創盛世設計，廈門鉑銳生物合成，其序列為：

1.5.3 血清BDNF 測定 采用ELISA 技術測定三組患者血清BDNF 濃度，采用北京四正柏生物科技有限公司的Human BDNF 試劑盒（型號：CHE0041），測 定 儀 為Spectramax Absorbance Reader 全自動酶標儀，各項操作具體程序嚴格按照試劑盒的說明書執行。

1.6 統計分析 采用SPSS 20.0 (IBM)分析數據。Mann-Whitney U 檢 驗 比 較AMC 組、PSCN 組 及PSCI 組的miR-134 相對表達和BDNF 水平；ANOVA 和χ2檢驗用于計量和計數資料中；Spearman 相關分析對miR-134 表達水平和MoCA 得分、BDNF水平進行比較。采用ROC曲線（receiver operator characteristic curve, ROC）和曲線下面積（Area under the Curve，AUC）對miR-134 的診斷能力進行評估。最大特異性和最大靈敏度的總和作為最佳診斷臨界點（cut-off point）。所有例數，包括真陽性（true positive,TP）、真陰性（true negative,TN）、假陽性（false positive,FP）、假陰性（false negative, FN）都是通過最佳臨界點計算而來。靈敏度、特異性、準確性的計算公式如下：靈敏度=TP/（TP+FN）=真陽性例數/所有陽性例數；特異性=TN/（TN+FP）=真陰性例數/所有陰性例數；準確度=（TN+TP）/（TN+TP+FN+FP）=所有正確診斷例數/所有例數。

2 結果

2.1 三組患者一般資料比較 人口統計學數據、生化數據見表1。其中，在AMC 組、PSCN 組、PSCI組組間糖尿病、高血壓例數存在顯著統計學差異。

表1 三組一般資料情況

2.2 三組患者的血清miRNA 表達水平比較miRNAs 的Ct 值見表2，其中，在AMC 組、PSCN 組、PSCI 組組間MoCA 評分存在顯著統計學差異。U6是本研究的內參，其Ct值在3組間無顯著統計學差異（P= 0.13）。血清miR-134 的相對表達水平是通過內參Ct 值標準化得來的（2-ΔΔCt）。miR-134 的表達水平在3 組間存在顯著統計學差異（Kruskal-Wallis 檢驗,P＜0.01）。PSCI 組miR-134 及BDNF 表達水平最低，PSCN 組次之，AMC組最高。miR-134 及BDNF 表達水平，在PSCI 組和PSCN 組組間兩兩比較結果為：存在顯著統計學差異（Mann-Whitney 檢驗,P＜0.01）；在PSCI組和AMC 組組間兩兩比較結果為：存在顯著統計學差異（Mann-Whitney 檢驗，P＜0.01）。這些結果表明，目前所觀察到的樣本是適合于進一步分析的。與其他兩組相比，PSCI 組患者血清miR-134的相對表達是顯著下調（P＜0.01）。

表2 三組血清miR-134及BDNF水平比較

2.3 miR-134 相對表達水平與認知功能間相關性本研究分析了MoCA 得分與血清miR-134間的相關性。通過進行Spearman 相關分析，結果顯示MoCA 得分與血清miR-134 相對表達間存在中度正相關（r=0.613,P＜0.01）（圖1）。

圖1 miR-134相對表達水平與認知功能間相關性

2.4 miR-134 診斷性能用于篩查PSCI 本研究采用ROC 曲線和AUC 對miR-134 的診斷能力進行評估，見圖2。采用SPSS 20.0 對miR-134 的相對表達量進行ROC曲線分析，ROC曲線圖見圖2-6，得 到AUC（95%CI）為0.849（0.749-0.948）（P＜0.01），在0.7-0.9 范圍內，表明miR-134 診斷腦卒中后認知功能障礙的價值中等。Cut-off point 根據SPSS 中統計結果中的特異度和靈敏度的總和最大值得出，Cut-off point=0.82。根據Cut-off point 計算得出TP 為24 例、FP 為11 例、TN 為18例、FN 為3 例，并計算得出：敏感度、特異度分別為88.89%、62.07%，提示miR-134 診斷腦卒中后認知功能障礙具有較好的靈敏度及特異度。

圖2 miR-134的ROC曲線及曲線下面積

2.5 血清miR-134 表達水平與BDNF 的相關性分析PSCI 組患者血清BDNF 的表達水平為2.068（1.932，2.204），通過進行Spearman 相關分析，結果顯示PSCI 患者血清miR-134 相對表達量與BDNF 水平呈現中度正相關（r = 0.734，P＜0.01）（圖3）。

圖3 miR-134表達水平與BDNF的相關性分析

3 討論

據報告，國人PSCI 的發病率約為55.9%[7]，嚴重影響患者的生活質量，給家庭與社會帶來沉重的負擔。卒中后認知障礙是可以早期預防和治療的疾病，因此，及早發現并對其進行針對性干預十分重要。血液生物學標志物的檢測對于疾病的早期篩查有很大的幫助，研究證實[5,8]，miRNAs 在神經系統的分化與發育、突觸可塑性的形成、學習記憶能力的維持等方面發揮著重要作用。我們前期研究發現[9]：血清miR-132 表達越高則卒中后越可能發生認知障礙。動物研究證明：miR-132 刺激[10]軸突生長，而miR-134 抑制[11-12]軸突生長。因此，探討血清miR-134 表達和腦卒中后認知功能之間的關系有助于為卒中后認知障礙早期診斷、早期干預，為其提供更加準確的客觀依據。

本研究，3 組對象的年齡、性別、受教育程度均相匹配。本研究發現PSCI 組血清miR-134 表達水平及血清BDNF 水平顯著下降（P＜0.01），提示miR-134與PSCI 密切相關。miR-134是首次發現的樹突microRNA，富集于大鼠海馬神經元的神經元樹突中，負性控制樹突棘[13]的大小，miR-134 通過靶向Lim 結構域激酶1（LimK1）調節樹突脊柱的發育，而LimK1被BDNF抑制[14]。Liu等人[15]發現miR -134 -5p 參與了血管性癡呆（VD）大鼠的認知功能障礙。此外，miR-134 還參與了sirt1 介導的CREB 和BDNF 表達調控，大鼠腦中Sirt1 缺乏導致miR-134 表達上調，未抑制的miR-134直接抑制CREB mRNA的翻譯，導致CREB和BDNF 下調，使得突觸可塑性和記憶功能受損[16]。Liu 等人[17]研究發現在大腦中動脈閉塞引起的認知功能障礙的大鼠腦中miR134升高，電針可降低大鼠海馬區miR-134 的表達，從而負調控LimK1以增強突觸樹突可塑性，并認為miR-134 介導的LimK1 參與了電針誘導的海馬突觸可塑性，可以作為缺血性腦卒中恢復期改善學習、記憶能力的一個有利因素。由此推測PSCI 患者miR-134 的上調抑制了BDNF 的表達，導致患者認知功能障礙，提示血清可能是PSCI的危險標記物。本研究也發現，血清miR-134 水平與MoCA 評分呈正相關（P＜0.01）；此外，本研究構建了PSCI 診斷的ROC 曲線，曲線下面積為0.849（P＜0.01），顯示其具有良好的應用價值，且敏感度、特異度分別為88.89%、62.07%，可作為PCSI 診斷的較好的血清學指標。或許，miR-134 可以作為腦卒中患者認知康復訓練是否有效的血清學指標之一。

綜上所述，通過測定PSCI 患者血清中miR-134 水平或許可以作為PSCI 患者認知功能及其變化的判斷依據。但本研究也存在一定的局限性，今后將擴大樣本量，分析不同階段的PSCI 患者體miR-134 水平變化，或從細胞和動物層面深入探討miR-134在神經退行性疾病中調控作用背后的分子機制，以進一步驗證miR-134 作為PSCI生物學標記物的康復價值。