QuEChERS-氣相色譜–串聯質譜法測定糧谷和油料油脂中矮壯素殘留

劉付英，楊水艷，郭 穎，邵志凌

（云南省糧油科學研究院（云南省糧油產品質量監督檢驗測試中心），云南 昆明 650033）

矮壯素（chlormequat，CCC），化學名為氯化氯代膽鹼或2-氯乙基三甲基氯化銨，是一種優良的季銨鹽類植物生長調節劑，主要用于小麥、水稻、水果等作物[1-3]。近年來，由于植物生長調節劑在農產品生產中的大量使用以及可能導致的農產品的品質發生變化，使得人們對植物生長調節劑的關注越來越高。研究表明[4]，即使在低于日允許攝入量（ADI）濃度水平下，矮壯素對動物的繁殖能力仍有不良影響。目前，歐盟、國際食品法典委員會（CAC）、日本等均對矮壯素在食品中的殘留量制定了嚴格的限量標準（表1）。2020年美國環保署發布了2020-10483和2020-10331號條例，修訂矮壯素在燕麥類中的殘留限量為40 mg/kg。我國現行的《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）規定了谷物、油料和油脂2大類14小類中矮壯素的殘留限量和標準方法，限量為0.1～10 mg/kg，谷物按照《糧谷中矮壯素殘留量的測定》（GB/T 5009.219—2008）測定，油料和油脂參照該標準執行，主要采用氣相色譜質譜法，檢出限為0.01 mg/kg。

表1 國內外農產品中矮壯素最大殘留限量Table 1 Maximum residue limits of chlormequat in agricultural products at home and abroad mg/kg

目前國內外關于矮壯素的檢測方法主要有薄層色譜法[5-6]、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[7-9]、液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS[10-27]和離子色譜法[28]等，常用的前處理方法有直接萃取法[13,29-30]、固相萃取（SPE）法[17-20,23-24]、QuEChERS法[25-27,31-33]等。糧食谷物中矮壯素的檢測[7,18-19]主要采用液相色譜-串聯質譜法和氣相色譜-質譜法，前處理是固相萃取法（SPE）。SPE法凈化效果較好，操作簡單，但存在凈化方法相對單一、消耗時間等不足，難以滿足同時凈化理化性質差異較大的多種化合物[34]。QuEChERS是一種新型分散固相萃取技術，是Quick（快速）、Easy（簡單）、Cheap（便宜）、Effective（高效）、Rugged（耐用）和Safe（安全）的縮寫，此方法主要是通過鹽析分層，利用基質分散萃取原理，采用適當的吸附劑填料（C18、PSA、GCB等）與干擾物結合，通過離心去除基質（如色素、糖、脂肪等）干擾以達到凈化的目的。該方法具有快速、高效、經濟、安全等優點，被廣泛應用于各類食品檢測中。同時隨著色譜-質譜技術的發展，尤其是二級質譜（MS/MS）相對一級質譜（MS）來說，其抗干擾能力更強，對樣品前處理的要求更低，QuEChERS結合高靈敏度的色譜-串聯質譜分析會帶來更好的測定效果。目前采用QuEChERS方法前處理測定糧食和油料油脂中矮壯素殘留的氣相色譜-串聯質譜法尚無相關研究報道。本工作結合谷物、油料和油脂其基質和性質的差異，以《糧谷中矮壯素殘留量的測定》（GB/T 5009.219—2008）方法為基礎，考察了氣相色譜-串聯質譜檢測條件，衍生劑、提取溶劑、凈化劑等因素的影響，建立了QuEChERS-氣相色譜-串聯質譜（GCMS/MS）測定糧谷和油料油脂中矮壯素殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

矮壯素甲醇標準溶液（100 mg/L）：安諾倫（北京）生物科技有限公司；乙腈、2-丁酮為分析純：國藥集團有限公司；甲醇、無水硫酸鎂、氯化鈉為分析純：天津市風船化學試劑科技有限公司；苯硫酚鈉（90%純度）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（HPLC級）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；C18、PSA（40-60 μm）：天津博納艾杰爾科技有限公司；檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉為分析純、ZrO2珠：北京Ability公司。

1.2 儀器設備

TSQ9000三重串聯四級桿氣質聯用儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；XT-NS1全自動氮吹濃縮儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；SiO-6512 QuEChERS-全自動樣品制備系統（配有渦流振動離心機、12位均質離心轉子、均質分離工作站）：北京本立科技有限公司；PM200行星式球磨儀：德國RETSCH（萊馳）公司；3100型-實驗磨：瑞典波通儀器公司；CD1仿工業實驗磨粉機：法國肖邦技術公司；JLG-II檢驗用礱谷機：中儲糧成都糧食儲藏科學研究所；JNM-III碾米機：中儲糧成都糧食儲藏研究院有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

稻谷樣品經礱谷機脫殼后用碾米機碾成大米，與玉米樣品通過波通磨進行粉碎（80目）；小麥經磨粉機制成小麥粉，大豆、油菜籽經球磨儀粉碎。所有粉碎后的樣品裝入容器后密封，于0～4 ℃冷藏保存。

1.3.2 樣品前處理

分別稱取糧谷5.00 g、植物油2.00 g、油料3.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，依次加入 5 mL 水、ZrO2珠（24粒）、15 mL 乙腈、1.25 g氯化鈉、4.00 g無水硫酸鎂，裝入凈化內管（含100 mg無水硫酸鎂、100 mg C18、100 mg PSA），放入SiO-6512主機中，按設定程序運行（提取：2 000 r/min渦旋20 min，4 500 r/min離心5 min；凈化：2 000 r/min渦旋20 min，4 500 r/min離心5 min）。準確移取2 mL內管上清液，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL質量濃度2 mg/mL的苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液，60 ℃水浴中衍生30 min，冷卻混勻后過0.22 μm 有機濾膜，供GS-MS/MS測定。

1.3.3 標準溶液的配制

矮壯素標準工作液（5 mg/L）：精確移取矮壯素（100 mg/L）100 μL用甲醇稀釋成質量濃度為5 mg/L標準工作液，用于質譜工作條件的優化和探索；取適量矮壯素標準溶液（100 mg/L），用甲醇配制成質量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL的系列標準工作溶液，現配現用。

1.3.4 色譜和質譜條件

色譜柱：TG-5SILMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度 50 ℃，保持 1 min，以 8 ℃/min升溫至170 ℃，再以25 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min；載氣：氦氣（純度≥99.999%），流速：1.20 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣體積：1 uL。

質譜條件：離子源：EI源；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；電子能量：70 eV；掃描方式：多反應離子監測（SRM），矮壯素與苯硫酚鈉衍生物定量離子對136-135，碰撞電壓8 V；定性離子對 136-91，碰撞電壓 20 V；定性離子對135-65，碰撞電壓28 V。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

采用程序升溫條件，選擇 TG-5SILMS弱極性色譜柱，用質量濃度為5 ug/mL的矮壯素衍生溶液，ESI+模式下對質量數 50～500進行全掃描（fullscan），選擇目標化合物質譜圖中 2個強度較大的碎片離子136，135作為母離子，逐步對子離子及碰撞能（CE）進行優化，最終確定能量最強、效果最優的136-135作為定量離子對，碰撞電壓8 V；136-91為定性離子對，碰撞電壓20 V；135-65為定性離子對，碰撞電壓28 V，見圖1。在此條件下測定的矮壯素標準溶液衍生物的離子圖見圖2。

圖1 不同離子對的碰撞電壓優化曲線Fig.1 Optimization curve of collision voltage for different ion pairs

圖2 矮壯素標準溶液衍生物的離子圖Fig.2 Ion chromatogram of chlormequat standard solution derivatives

2.2 樣品前處理條件優化

2.2.1 提取溶劑的選擇

矮壯素具有強極性，易溶于水、甲醇和乙腈等溶劑，常采用乙腈、酸化乙腈、甲醇水、甲醇-乙腈等溶劑提取，趙永信等[7]采用甲醇-乙腈（1∶4，v/v）混合溶液提取大米、玉米中的矮壯素，固相萃取法凈化，回收率達到62.0%～91.6%；曹慧[7]等用甲醇-水-乙酸（22∶77∶1，v/v/v）混合溶液提取大米、玉米、小麥等樣品的矮壯素，固相萃取小柱凈化，回收率為77.7%～93.1%。考慮矮壯素的極性和溶解性，本工作以小麥粉、大米、大豆、菜籽油為基質樣品，添加0.5 ug/kg的矮壯素標準溶液，比較了乙腈、甲醇-乙腈（1∶4，v/v）、甲醇-乙腈（1∶1，v/v）、甲醇-乙腈（4∶1，v/v）、甲醇的提取效果，如圖4所示，結果顯示乙腈和甲醇-乙腈（1∶4，v/v）作為提取溶劑時，矮壯素的提取效率較好，回收率均大于80%，且提取液雜質較少。隨著提取溶劑中甲醇量的增加，提取液中的干擾物變多，溶液變得混濁，提取效率也較低，原因可能是乙腈比甲醇有更好的除蛋白效果，綜合考慮本工作選擇乙腈作為提取溶劑。

圖3 矮壯素在不同基質樣品和不同提取溶劑中的提取效率Fig.3 Extraction efficiencies of the CCC in different matrix samples and different extraction

圖4 不同吸附劑對矮壯素基質效應的影響Fig.4 Effect of different adsorbent on matrix effect of CCC (n=3)

2.2.2 提取方式的優化

QuEChERS法由美國學者 ANASTASSIADES等[35]于 2003年首次提出，是一種針對蔬菜水果中多組分農藥殘留的凈化。由于蔬菜水果的含水量較大，當樣品含水量小于25%時，需在處理過程中加入水來增加細胞的通透性，以提高樣品在提取過程中農藥殘留的析出。本工作研究了小麥粉樣品中矮壯素添加水平為0.5 mg/kg時加水量不同及加水后不同操作的提取效果。受SiO-6512主機對提取管量程限制，實驗討論了樣品處理中不加水、加2 mL和5 mL水，其他步驟按1.3.2操作矮壯素的提取效率，結果顯示，不加水矮壯素的提取效率較低，回收率在20%左右，加5 mL水矮壯素的提取效率要優于加2 mL水的。加水后不同的操作：方式1樣品加水后渦旋振蕩2 min，靜置30 min后按1.3.2操作，結果顯示矮壯素基本沒有提取出來。方式2樣品加水后立即按1.3.2操作，矮壯素的回收率可以達到80%以上。加水后靜置與否對矮壯素回收率影響較大，主要原因是矮壯素具有強極性、易溶于水，在加水靜置的過程中，矮壯素已經溶于水中，后續加入乙腈萃取時，矮壯素在有機相中的分配較差，導致回收率偏低。

2.2.3 凈化方式的優化

糧谷中含有大量蛋白質、淀粉和脂肪，油料和油脂主要由脂肪酸甘油酯組成，在凈化過程中需盡可能地除去基質中的這些干擾物。本工作基于糧食和油料油脂高脂肪、高蛋白的基質特點，對QuEChERS方法進行了優化，通過調整不同吸附劑及其用量從而達到對目標物有最優的提取凈化效果。QuEChERS方法中常用的吸附劑主要有C18、PSA、GCB等，鑒于糧谷和油料油脂類樣品的基質，GCB價格昂貴等因素，本工作未對GCB吸附劑進行研究，重點研究了 C18和 PSA及其C18+PSA組合（含100 mg無水硫酸鎂）的凈化效果，并結合基質效應對吸附劑含量進行了優化。本工作在空白小麥粉、大米、油菜籽、菜籽油樣品中添加0.5 mg/kg矮壯素，加入不同質量吸附劑的實驗結果見圖 5。PSA+C18組合凈化效果較好，優于單個吸附劑使用時的效果，對于大米、小麥粉樣品，當PSA+C18的質量為50 mg+100 mg時，凈化效果最佳，基質效應隨 PSA、C18含量的增加并沒有明顯的變化；當PSA+C18的質量為100 mg+100 mg時，油菜籽、菜籽油的凈化效果最佳，提取液幾乎為無色，色譜圖中雜峰較少，增加PSA+C18的質量其基質效應并沒有明顯的變化。上述實驗結果顯示，PSA+C18組合已能夠有效去除提取液中脂肪、色素等干擾物，并能有效降低基質效應的影響。綜合考慮樣品基質、儀器污染、去除雜質效果等因素，本工作選擇100 mg C18+100 mg PSA（含100 mg無水硫酸鎂）的組合作為QuEChERS的凈化吸附劑。

2.2.4 衍生條件的優化

矮壯素為季胺鹽類化合物，極性高不容易氣化，無法直接進行氣相色譜分析，需要進行衍生化反應。矮壯素衍生化使用的試劑有苯硫酚鈉[7]和五氟代苯硫酚鹽[8]，其與苯硫酚鈉的衍生物為苯基乙烯基硫醚，通過測定揮發物苯基乙烯基硫醚的含量確定樣品中矮壯素的殘留量。《糧谷中矮壯素殘留量的測定》（GB/T 5009.219—2008）方法是在氮氣環境下加入2 mL 6 mg/mL的苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液，于80 ℃下反應30 min，然后用 GC/MS進行定性、定量分析。本工作比較了 2.0、4.0、6.0 mg/mL苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液各1 mL在60、70、80 ℃下反應30、40、50 min對0.5 μg/mL矮壯素標準工作液的衍生效果。

通過正交實驗結果分析（表2），以2.0 mg/mL苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液在60 ℃下衍生30 min效果最佳。當苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液濃度大于2.0 mg/mL時，衍生反應的產率變化不大，但苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液濃度越高對色譜柱及離子源污染越大。在60 ℃反應30 min衍生反應已基本完成，隨著時間和溫度的增加，衍生產物的產率無明顯變化。故本工作確定衍生化條件為提取液中加入1 mL質量濃度2.0 mg/mL苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液，在60 ℃下反應30 min，衍生劑現用現配。

表2 矮壯素衍生化正交實驗Table 2 Orthogonal experiment of derivatization of CCC

方法的不足和局限性：矮壯素與苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液在衍生過程中生成的干擾產物較多，見圖 5。衍生劑之間、衍生劑與試劑之間會相互反應，生成產物的干擾會降低被測目標物的靈敏度。另外衍生目標物不包含矮壯素的特征結構，其他季銨鹽類物質也可能發生脫烷基化反應得到相同的衍生產物，該方法對矮壯素不具有特異性，當樣品中存在性質相近的組分時，定量分析的準確度無法保證。

圖5 矮壯素標準溶液衍生反應的主要副產物質譜圖Fig.5 Mass spectrum of main byproducts in derivative reaction of chlormequat standard solution

2.3 基質效應

基質效應是指基質成分和目標化合物在進行離子化時相互競爭而導致目標化合物信號強度有不同程度的增強或減弱的現象，包括基質增強效應和基質抑制效應[36-37]。目標物和樣品本身的性質均會影響其基質效應，而基質效應對目標物定量與定性的準確性也會有影響，因此對基質效應的評估非常必要。本工作采用基質中矮壯素衍生物響應值與純溶劑中矮壯素衍生物響應值的比值ME來進行，即ME=（基質中矮壯素標準溶液衍生物的峰面積/溶劑中矮壯素標準溶液衍生物的峰面積）×100%[38]。小麥粉、大米、玉米、大豆、大豆油、油菜籽、菜籽油空白樣品采用 1.3.2處理，用基質分別配制0.5 μg/mL的矮壯素標準溶液，考察矮壯素的基質效應。ME大于1為增強效應，ME小于1為抑制效應，結果顯示，矮壯素在不同基質樣品中均呈現不同程度的基質抑制效應，ME在 78.2%～98.4%之間。ME在 0.8～1.2時，通常認定為弱基質效應。除菜籽油外，其余樣品的基質效應均超過80%，為弱基質抑制效應。菜籽油可能是因為其基質中所含的色素、脂肪等內源性物質對檢測結果有較大的干擾，表現為中等基質抑制效應，本工作主要通過配制基質匹配標準曲線來消除基質效應的干擾[39]。

2.4 線性范圍、定量限和檢出限

以矮壯素衍生物的質量濃度（μg/mL）為橫坐標（x），矮壯素衍生物定量離子的峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，不同基質中矮壯素衍生物在0.05～2.0 μg/mL濃度范圍內有較好的線性關系，R2均大于0.998，結果見表3。

通過加標回收實驗，向空白樣品中添加不同水平濃度的矮壯素標準溶液，按照1.3.2方法對不同樣品進行前處理，以最低添加濃度的基質標準溶液進樣，分別以信噪比（S/N≥3）和信噪比（S/N≥10）計算方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），如表 3所示，矮壯素在不同基質下的 LOD為 0.004～0.006 mg/kg，LOQ為0.01～0.03 mg/kg。

表3 矮壯素在不同基質中的線性關系、檢出限和定量限Table 3 Linear relationships, LODs, and LOQs of CCC in different matrices

2.5 回收率與精密度

取7種陰性研究樣品進行加標回收實驗，加標水平分別為0.02、0.1、0.5 mg/kg，每個添加水平進行6次實驗結果見表4。矮壯素的平均回收率在 73.6%～99.1%，相對標準偏差在 2.34%～7.78%。方法的準確度和回收率完全滿足實驗室質量控制理化檢測中對回收率和精密度要求。

表4 不同基質中矮壯素的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 4 Spiked recoveries and RSDs of CCC in different matrices (n=6) %

2.6 樣品的檢測

隨機選取 45份市售及扦取的庫存糧食及油料油脂樣品，小麥粉6份、大米10份、玉米10份，大豆3份、油菜籽3份、大豆油5份、菜籽油8份進行矮壯素殘留檢測。結果顯示，有2份玉米樣品中檢出矮壯素，結果為 0.65 mg/kg和1.08 mg/kg，檢出值低于國家標準對其規定的最大殘留限量，其余樣品均未檢測出矮壯素。

3 結論

本研究通過完善優化國標方法中對糧食和油料油脂中矮壯素殘留前處理及測定條件，建立了QuEChERS-GC-MS/MS法測定糧谷和油料油脂中矮壯素殘留的分析方法，該方法高效、靈敏度高，線性關系、準確度和精密度均能滿足方法學對不同指標的要求。通過采用基質匹配標準曲線進行定量，能較大程度地消除基質干擾，且方法的定量限完全滿足不同國家和組織對矮壯素殘留限量標準的要求，可為糧食和油料油脂中矮壯素殘留的檢測提供具體有效的方法技術參考。