表沒食子兒茶素沒食子酸酯和小米谷糠蛋白的相互作用研究

苗向碩，常城銘，和東芹?

（1.邯鄲職業技術學院 食品與生物工程系，河北 邯鄲 056001；2.河北省高水平實訓基地，河北 邯鄲 056001）

小米谷糠是小米加工過程中產生的副產物。小米谷糠中蛋白質組分含量約占15%，小米谷糠蛋白是人們廣泛食用的優質谷物蛋白，小米谷糠蛋白氨基酸組成合理，比較接近世界衛生組織推薦的蛋白質的氨基酸比例，小米谷糠蛋白消化率高并且具有很低的過敏性，非常適合開發特殊人群及嬰幼兒營養食品。小米谷糠蛋白還具有保健及抑制腫瘤細胞的作用[1]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）在綠茶兒茶素成分中占比最高，EGCG含有多個酚羥基，具有抗菌、抗氧化、抗炎及抗病毒等特性[2]。由于EGCG安全性高且生物活性強，能夠提高食品中蛋白質的營養價值或賦予食品更好的性能，延長食品保質期，因而廣泛應用于各類食品[3]。

在食品體系中，EGCG會和蛋白質發生相互作用，進而改變食品體系中蛋白質的結構、功能，并進一步影響蛋白質的消化性質。因此EGCG與食品蛋白質相互作用的研究成為熱點。近年來富含小米谷糠蛋白和 EGCG的相關食品已有報道[4-6]，而并沒有 EGCG與小米谷糠蛋白相互作用的研究，本文采用內源熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見光譜法研究 EGCG與小米谷糠蛋白的相互作用，為開發含有EGCG和小米谷糠蛋白天然成分的復合食品及改善其品質提供相應的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

小米谷糠：河北威縣保榮米業有限公司；EGCG（純度≥98%）：上海源純生物科技有限公司；其它試劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司等。

1.2 主要儀器與設備

Sorvall LYNX 6000高速落地離心機：美國Thermo Fisher公司；真空冷凍干燥機：北京亞星儀科科技發展有限公司；F4700熒光分光光度計：日本日立公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小米谷糠蛋白提取

參考曹闊[7]的方法并稍作修改。以小米谷糠為原料，磨粉過80目篩，然后用正己烷充分浸泡小米谷糠，料液比為1∶5（w/v），然后密封置于35 ℃的恒溫箱中浸泡 12 h，后倒出上層溶劑，重復進行上述操作。抽濾后自然晾干就可得到脫脂小米谷糠。將小米谷糠與去離子水混合，料液比為1∶10（w/v），超聲30 min后，將料液置于45 ℃的恒溫攪拌器中充分攪拌4 h，攪拌期間不斷用1 mol/L NaOH調整料液pH，并使得pH值始終保持在9.0，然后在4 ℃，8 500 r/min的條件下，將懸浮液離心 15 min，并將上清液用1 mol/L HCL調pH至4，靜置20 min，然后在4 ℃，8 000 r/min的條件下將料液離心20 min，沉淀用水洗3次，加入適量的去離子水，將蛋白沉淀分散均勻，并用1 mol/L NaOH將蛋白調pH至7.0，冷凍干燥后得到實驗用小米谷糠蛋白。

1.3.2 內源熒光光譜測定

用pH 7.4的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液配制小米谷糠蛋白溶液濃度至1.5 mg/mL，將2 mL小米谷糠蛋白溶液加入10 mL試管中，隨后加入不同體積濃度為2 mg/mL的EGCG溶液，再用pH 7.4的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液將體積定容至3 mL，使得小米谷糠蛋白最終濃度為1 mg/mL，得到質量比為（1∶0、1∶0.005、1∶0.01、1∶0.02、1∶0.04、1∶0.06、1∶0.08、1∶0.10，小米谷糠蛋白∶EGCG，w/w）的小米谷糠蛋白- EGCG混合液，并將兩者充分混合均勻，掃描前將樣品置于17、25、37 ℃的恒溫水浴鍋中保溫5 min。激發波長設置為 290 nm，發射波長設置為 300～450 nm，激發和發射狹縫寬度依次設置為5和10 nm，掃描速度設置為1 200 nm/min，在上述條件下測定小米谷糠蛋白的內源熒光光譜。

1.3.3 同步熒光光譜測定

樣品制備方式同1.3.2，測定溫度條件為298 K，分別設置Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm，激發狹縫寬度為5 nm，發射狹縫寬度為10 nm，掃描速度設置為1 200 nm/min，掃描波長范圍為250～450 nm的小米谷糠蛋白同步熒光光譜。

1.3.4 三維熒光光譜測定

樣品制備方式同1.3.2，測定溫度條件為298 K，起始激發波長設置為 200 nm，激發波長范圍為200～350 nm，發射波長范圍為300～500 nm，激發狹縫寬度為5 nm，發射狹縫寬度為10 nm，掃描速度設置為1 200 nm/min，每間隔10 nm記錄1次，共掃描21次。

1.3.5 紫外-可見光譜測定

配置濃度為1 mg/mL的小米谷糠蛋白溶液，取3 mL上述蛋白溶液于石英比色池中，掃描波長范圍為250～500 nm內的吸收光譜，測定溫度條件為298 K，掃描完畢后，將不同質量濃度的小米谷糠蛋白-EGCG混合液充分混勻后靜置5 min加入到比色池中，在溫度條件為298 K時掃描吸收光譜。將濃度為1 mg/mL的小米谷糠蛋白溶液作為空白，記錄小米谷糠蛋白溶液的紫外-可見吸收差譜。

1.3.6 EGCG與小米谷糠蛋白結合距離的測定

配制濃度均為2×10-5mol/L 的小米谷糠蛋白和EGCG溶液，在25 ℃的條件下恒溫水浴保溫5 min。EGCG的紫外光譜測定：移取2×10-5mol/L的EGCG溶液3 mL于石英比色池中，掃描300～400 nm的紫外吸收光譜。小米谷糠蛋白溶液熒光光譜測定：移取3 mL小米谷糠蛋白溶液于石英比色池中，激發波長設置為290 nm，發射波長范圍為300～400 nm，激發狹縫寬度為5 nm，發射狹縫寬度為10 nm，掃描速度設置為1 200 nm/min，測定溫度條件為298 K。

1.4 數據分析

所有實驗平行測定3次。采用Microsoft Excel 2010和Origin Pro 8處理數據和繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 EGCG與小米谷糠蛋白相互作用的熒光光譜

2.1.1 EGCG濃度對小米谷糠蛋白內源熒光光譜的影響

小米谷糠蛋白的內源熒光光譜可以反映蛋白中色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸殘基附近微環境的改變。在本實驗條件下，由于EGCG的濃度很小，所產生的熒光發射信號很弱，可以忽略EGCG對小米谷糠蛋白熒光信號的干擾，因而不考慮文中“內濾光效應”的干擾問題[8]。圖1表明，隨著EGCG濃度的增大，小米谷糠蛋白的熒光強度顯著降低，說明EGCG大幅度淬滅了小米谷糠蛋白的內源熒光；同時，小米谷糠蛋白最大熒光發射波長由345 nm紅移至368 nm，表明隨著EGCG濃度的逐漸增大，小米谷糠蛋白的芳香族氨基酸殘基微環境疏水性降低，極性增強，小米谷糠蛋白空間結構逐漸變得更加延伸[9]。

圖1 不同濃度EGCG對小米谷糠蛋白內源熒光光譜的影響Fig.1 Endogenous fluorescence spectra of millet bran protein at different concentrations of EGCG

2.1.2 EGCG濃度對小米谷糠蛋白同步熒光光譜的影響

同步熒光光譜不僅可以區分開小米谷糠蛋白酪氨酸殘基和色氨酸殘基特征光譜，還可進一步判斷EGCG與小米谷糠蛋白相互作用位點更接近酪氨酸殘基或色氨酸殘基。Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm時分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征[10]。由圖2可以看出，Δλ=15時，小米谷糠蛋白酪氨酸殘基的同步熒光強度隨著EGCG濃度的增加而降低，最大發射波長由359.4 nm紅移至367.4 nm，當Δλ=60 nm時，小米谷糠蛋白色氨酸殘基的同步熒光強度隨著EGCG濃度的增加降低，最大發射波長由289.4 nm紅移至292.2 nm，隨著EGCG濃度的升高，色氨酸殘基的同步熒光強度降低程度更明顯，表明EGCG和小米谷糠蛋白相互作用同時影響酪氨酸殘基和色氨酸殘基微環境的疏水性，但對色氨酸殘基周圍微境影響程度更大，EGCG在小米谷糠蛋白上的結合位點更靠近色氨酸殘基，小米谷糠蛋白結構變得疏松，與內源熒光光譜結果一致。由于不考慮“內濾光效應”的干擾，Δλ=15 nm 的光譜峰型出現鋸齒狀，筆者認為其與靈敏度參數設置有關，具體原因有待進一步研究。

圖2 不同濃度EGCG對小米谷糠蛋白同步熒光光譜的影響Fig.2 Synchronous fl uorescence spectra of millet bran protein with different concentrations of EGCG

2.1.3 EGCG濃度對小米谷糠蛋白三維熒光光譜的影響

三維熒光光譜中的峰位、顏色和指紋信息可以反映蛋白質的熒光強度和構象變化。如圖3所示，峰a（Ex=Em）為瑞利散射峰，峰b（Em= 2Ex）為二級散射峰，峰1為小米谷糠蛋白色氨酸和酪氨酸殘基特征峰，峰2代表多肽鏈主鏈上的C==O結構的π→π*躍遷產生的熒光峰[9]。如圖3所示，加入EGCG后，峰1顏色明顯變淺，等高線變得明顯稀疏，表明EGCG能淬滅小米谷糠蛋白熒光，EGCG與小米谷糠蛋白之間存在相互作用。峰 2顏色變淺，面積發生改變，表明小米谷糠蛋白質多肽鏈骨架結構發生改變。表1中的峰1數據顯示，小米谷糠蛋白的色氨酸和酪氨酸殘基的最大發射波長出現了紅移，說明小米谷糠蛋白色氨酸和酪氨酸殘基周圍的微環境極性增強，疏水性降低，與小米谷糠蛋白的內源熒光和同步熒光光譜變化結果一致。峰b的熒光強度下降的原因可能是兩者相互作用使小米谷糠蛋白表面的保護水層受到破壞，小米谷糠蛋白更加分散，導致小米谷糠蛋白粒徑變小，降低了小米谷糠蛋白的光散射作用，從而降低二級散射峰的熒光強度，表明EGCG和小米谷糠蛋白相互作用形成不發光基態復合物。

圖3 未添加EGCG和EGCG濃度為0.04 mg/mL的小米谷糠蛋白等高線圖Fig.3 Contour map of millet bran protein and EGCG-millet bran protein system (0.04 mg/mL)

表1 EGCG-小米谷糠蛋白體系三維熒光光譜特征參數Table 1 Characteristic parameters for the three-dimensional fluorescence spectra of EGCG and millet bran protein system

2.2 EGCG與小米谷糠蛋白相互作用的紫外-可見吸收光譜

紫外-可見吸收光譜是研究復合物形成和蛋白質結構變化的簡單而有效的方法[11]。動態猝滅只影響到蛋白分子的激發態，不會改變蛋白的紫外吸收光譜，靜態猝滅由于生成新的基態復合物而導致吸收光譜的改變。蛋白的特征吸收峰（大約280 nm）主要是包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸在內的芳香族氨基酸的吸收峰[12]。由圖4可得，隨著EGCG含量增加，小米谷糠蛋白吸光度逐漸上升，表明EGCG與小米谷糠蛋白相互作用形成基態復合物。隨著EGCG濃度的增加，芳香族氨基酸最大吸收峰波長發生紅移，與同步熒光結果的變化一致，一方面可能是由于小米谷糠蛋白中色氨基酸殘基被EGCG結合，另一方面可能是兩者相互作用使色氨酸殘基位置發生移動，新的共軛體系由此產生，使π-π*躍遷能量增大[13]。耿子蔚[12]等研究不同茶湯與乳清蛋白相互作用時紫外-可見吸收光譜峰型也出現鋸齒狀，筆者認為其與靈敏度參數設置有關，具體原因有待進一步研究。

圖4 不同濃度EGCG對小米谷糠蛋白紫外-可見吸收光譜的影響Fig.4 UV-Vis absorption spectra of millet bran protein with different mass concentrations of EGCG

2.3 EGCG與小米谷糠蛋白相互作用機制

2.3.1 熒光淬滅機制

內源熒光光譜結果表明，EGCG能顯著淬滅小米谷糠蛋白的熒光，分析它們的淬滅機制可以更準確地判斷兩者相互作用是否形成了復合物。熒光淬滅機制總共包括3類，分別為靜態淬滅機制、動態淬滅機制和動態靜態混合淬滅機制。動態猝滅是猝滅劑和處在激發態的熒光物質碰撞而引發，隨著溫度升高，動態猝滅常數增大。靜態猝滅是猝滅劑和處于基態的熒光物質形成了復合物，隨著溫度升高，復合物的穩定性下降，因此猝滅常數隨著溫度升高而降低[14]。可采用Stern-Volmer方程[13]計算不同溫度下的淬滅常數，由此判斷EGCG與小米谷糠蛋白相互作用淬滅機制。

第三，多媒體激發學生學習興趣。歷史課堂教學過程中，激發學生的學習興趣可通過新技術的應用。傳統歷史教學當中學生處在被動的位置，并且整個課堂是靜態的，在新的教學環境下，就要充分注重教學模式的創新。多媒體技術在歷史教學課堂當中加以應用，就能為學生呈現出動態化的學習環境，這對激發學生學習興趣就有著積極意義。通過多媒體的應用將歷史教學內容和影片相結合，讓學生通過動態化的視頻呈現了解歷史，這就能激發學生學習興趣。

Stern-Volmer方程如下：

式中：F0和F分別是EGCG加入前后的小米谷糠蛋白熒光強度；[Q]是EGCG濃度（mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數（L/(mol·s)）；Ksv為動態猝滅常數（L/mol）；τ0為不存在猝滅劑時熒光體的壽命（生物大分子的平均壽命約為10-8s）。

由圖5中直線的斜率得到Ksv，由τ0得到Kq（表2）。當R2不大于0.98時，表明淬滅機制可能為動態靜態混合淬滅[15]。由圖5所示，EGCG濃度較低時，Stern-Volmer曲線呈現較好的線性關系，EGCG濃度較高時，Stern-Volmer曲線逐漸偏向縱坐標軸，表明EGCG與小米谷糠蛋白相互作用同時存在靜態淬滅和動態淬滅[16]，隨著溫度升高，Ksv的值不斷增大，表明 EGCG與小米谷糠蛋白相互作用存在動態淬滅機制。另外，由于不同溫度下Kq達到1012或1013，顯著高于最大動態猝滅速率常數（約為 2×1010L/(mol·s)），表明 EGCG 對小米谷糠蛋白的猝滅機制也存在靜態淬滅，結合分析熒光光譜和紫外-可見吸收光譜的變化結果，靜態淬滅在EGCG淬滅小米谷糠蛋白熒光過程中起主導作用[17]。

圖5 不同溫度條件下EGCG對小米谷糠蛋白熒光猝滅的Stern-Volmer方程曲線圖Fig.5 Stern-Volmer plots of millet bran protein interacting with EGCG at different temperatures

表2 EGCG-小米谷糠蛋白復合物的熒光淬滅常數及相關系數Table 2 Quenching rate constants and correlation coef fi cients of millet bran protein and EGCG

2.3.2 EGCG-小米谷糠蛋白復合物的結合常數、結合位點數

可以采用以下等式確定結合常數（KA）和結合位點數（n）[12]：

式中：F0表示沒有加入EGCG時的熒光強度；F表示加入EGCG時的熒光強度；KA為表觀結合常數；n為結合位點數；[Q]為EGCG的濃度。

從圖6和表3中可以看出，結合常數KA的數量級為106，相關研究報道EGCG與乳清蛋白[12]相互作用KA數量級是104，表明EGCG與小米谷糠蛋白之間結合力更強，可能是由于小米谷糠蛋白與乳清蛋白結構不同導致兩者數量級出現差異。隨著溫度升高，KA值不斷增大，一方面說明EGCG對小米谷糠蛋白的淬滅反應是吸熱反應，同樣也表明其淬滅過程有動態淬滅。在三個不同溫度條件下，結合位點數n全部約等于1，表明EGCG和小米谷糠蛋白形成1個結合位點。

圖6 不同溫度條件下EGCG熒光猝滅小米谷糠蛋白的雙對數曲線Fig.6 Double logarithmic curves of millet bran protein quenched by EGCG at different temperatures

表3 EGCG-小米谷糠蛋白復合物的結合位點數、表觀結合常數及相關系數Table 3 Apparent binding constants, binding sites numbers,and correlation coefficients of millet bran protein and EGCG

2.3.3 EGCG-小米谷糠蛋白復合物的熱力學參數和作用力類型

式中：R為氣體常數 8.314 J/(K·mol)；T為實驗溫度；KA為不同溫度的結合常數（見表3）。

如表4所示，ΔG＜0，表明EGCG與小米谷糠蛋白的反應可自發進行。ΔH＞0，表明 EGCG與小米谷糠蛋白之間反應為吸熱反應，升溫有利于反應進行，這與表3計算的KA隨溫度升高而增大一致。ΔH＞0、ΔS＞0表明EGCG與小米谷糠蛋白相互作用力類型主要是疏水相互作用。

表4 不同溫度下EGCG與小米谷糠蛋白相互作用的熱力學參數Table 4 Thermodynamic parameters for interaction between EGCG and millet bran protein

2.3.4 EGCG與小米谷糠蛋白的能量轉移和結合距離

根據 F?ster’s偶極-偶極非輻射能量轉移理論，蛋白質和小分子配體之間發生能量轉移需要滿足以下條件：蛋白質給體能發射熒光，蛋白熒光發射光譜與小分子配體的紫外吸收光譜有重疊，蛋白質與配體間結合距離小于7 nm。由以下公式可計算兩者重疊積分J、能量轉移效率E、結合距離r及臨界能量轉移距離R0[19]。

式中，F(λ)為蛋白質給體在波長λ處的熒光強度；E為能量轉移效率；F和F0分別表示添加淬滅劑前后蛋白熒光強度；ε(λ)則為小分子配體在波長λ處摩爾消光系數；J是重疊面積積分；R0是指能E=50%時的臨界距離；r為結合距離；K2為偶極空間取向因子（值為2/3）；N為介質折射指數（值為1.336）；Φ為給體熒光量子效率（值為 0.118）。

由圖 7根據公式（7）計算得J=1.207 2×10-14(cm3·L/mol)，E=0.602 9，R0=2.530 1 nm，r=2.341 8 nm。結合距離遠遠小于7 nm，而且結合距離符合0.5R0＜r＜1.5R0，這表明小米谷糠蛋白與EGCG存在非輻射能量轉移。EGCG淬滅小米谷糠蛋白熒光原因可能是兩者之間存在非輻射能量轉移引起的[19]。同時，EGCG與小米谷糠蛋白結合距離r值較小同樣表明兩者之間存在相互作用。

圖7 EGCG紫外吸收光譜和小米谷糠蛋白熒光發射光譜重疊圖Fig.7 Spectral overlap of EGCG absorption spectrum and millet bran protein fl uorescence spectrum

2.3.5 EGCG與小米谷糠蛋白結合率的預測

EGCG的小米谷糠蛋白結合率能直觀的體現出EGCG-小米谷糠相互作用強度。當兩者相互作用達到動態平衡時，同時兩者結合位點數接近 1時，可以建立兩者結合率的理論模型。以下公式可表征結合常數（KA）和結合率（Y）之間的關系[20]：

式中，Y是結合率；KA結合常數；P是小米谷糠蛋白濃度；X是EGCG與小米谷糠蛋白的濃度比。運用公式（8）計算不同溫度時 EGCG的小米谷糠蛋白結合率。

如圖8所示，EGCG 的小米谷糠蛋白結合率具有明顯的濃度依賴性，隨著EGCG濃度增大，結合率逐漸減小，溫度變化對結合率產生影響，尤其是 290 K時變化較明顯。由圖 8得到溫度290、298、310 K時的兩者濃度比與結合率曲線方程如下：

圖8 不同溫度條件下EGCG與小米谷糠蛋白的結合率Fig.8 Binding rate of millet bran protein and EGCG at different temperatures

由公式可見，當EGCG與小米谷糠蛋白濃度在一定范圍內波動時，EGCG的小米谷糠蛋白結合率可能出現指數級變化，可以通過測定EGCG和小米谷糠蛋白濃度比，由公式（9）～（11）計算其結合率。

3 結論

通過內源熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見光譜法研究了 EGCG與小米谷糠蛋白的相互作用，內源熒光光譜結果和同步熒光光譜結果均表明EGCG與小米谷糠蛋白之間存在相互作用，主要影響的是色氨酸殘基在空間結構中所處的微環境。三維熒光、紫外-可見光譜均證明EGCG影響了色氨酸和酪氨酸殘基微環境并使小米谷糠蛋白質多肽鏈的骨架發生變化。EGCG引起的小米谷糠蛋白熒光淬滅機制是動靜態混合猝滅，但以靜態淬滅為主。EGCG和小米谷糠蛋白結合常數KA的數量級可達106，且結合位點數約為1。熱力學參數表明EGCG和小米谷糠蛋白主要以疏水相互作用結合形成復合物，反應可自發進行。同時，EGCG與小米谷糠蛋白之間結合距離遠小于7 nm，兩者存在能量轉移。最后，建立了EGCG與小米谷糠蛋白結合率的理論模型，發現 EGCG的小米谷糠蛋白結合率隨著EGCG濃度的增大而減小，溫度變化對EGCG的小米谷糠蛋白結合率產生影響。