3種金銀花提取物抗細(xì)菌內(nèi)毒素的作用研究

任 濤 龐玉蓮 薛詩(shī)夏 陳 旭 張雨涵 楊 劍 譚艾娟 呂世明*

（1貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

細(xì)菌性腹瀉是人和動(dòng)物的常見(jiàn)疾病，細(xì)菌毒素引起的劇烈腹瀉、多器官損傷和脫水是細(xì)菌性腹瀉的主要危害[1]。目前，臨床主要通過(guò)抗菌、支持療法治療細(xì)菌性腹瀉，但抗菌藥物治療在殺死細(xì)菌的同時(shí)也可造成細(xì)菌內(nèi)毒素突擊釋放而危及生命[2]。革蘭氏陰性細(xì)菌在死亡后釋放的內(nèi)毒素為細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，過(guò)多的細(xì)菌內(nèi)毒素可在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)發(fā)生一系列嚴(yán)重的病理反應(yīng)。因此，在探索抗菌治療的同時(shí)降低細(xì)菌毒素危害的途徑，對(duì)安全、有效地指導(dǎo)治療細(xì)菌性腹瀉具有重要意義，目前對(duì)這方面的研究鮮有報(bào)道。

金銀花是重要的中藥材，其具有良好的抗炎[3-7]、抗菌[8-11]、抗病毒[12-16]等作用。已有研究表明，金銀花能減輕腹瀉時(shí)細(xì)菌毒素導(dǎo)致的危害[17]。在前人研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，金銀花的體外抑菌活性較好，但是目前對(duì)金銀花體外抗細(xì)菌內(nèi)毒素的研究較少。基于此，本試驗(yàn)擬研究金銀花不同提取物如水提取物、醇提取物、石油醚提取物等的體外抗細(xì)菌內(nèi)毒素作用，以期為后續(xù)金銀花抗細(xì)菌內(nèi)毒素的作用機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料。供試材料有：金銀花干花，購(gòu)自北京同仁堂（安國(guó)）中藥飲片有限公司；乙酸乙酯、石油醚、無(wú)水乙醇、濃鹽酸、醋酸，均為國(guó)產(chǎn)分析純；顯色基質(zhì)鱟試劑（end-point chromogenic tachypleus amebocyte lysate，EC TAL），購(gòu)自廈門(mén)鱟試劑生物科技股份有限公司。

1.1.2 儀器。供試儀器包含旋渦混合器（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）、LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)）、FA2004型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）、分光光度計(jì)（南京菲勒儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）、250 mL玻璃蛇形索氏提取器（崇州市蜀玻科學(xué)儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金銀花提取液的制備。分別采用水提法、乙醇回流提取法和石油醚回流提取法制備金銀花的提取液。

（1）水提法。將金銀花干花粉碎制成細(xì)粉，取10 g金銀花細(xì)粉溶于160 mL蒸餾水中，提取溫度為80℃，煎煮1次用時(shí)1.5 h。得到的水提物經(jīng)紗布過(guò)濾4次，然后抽濾1 h，再經(jīng)轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心8 min取上清液，得到水提取物。

（2）乙醇回流提取法。準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g金銀花細(xì)粉并用濾紙封閉，加入160 mL 75%乙醇中，提取溫度為95℃，回流2次，用時(shí)200 min。將提取液抽濾10 min，在95℃條件下分餾出無(wú)水乙醇回收處理，再經(jīng)轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心8 min，取上清液，獲得乙醇提取物。

（3）石油醚回流提取法。精確稱(chēng)取金銀花干花10 g加入160 mL石油醚，50℃回流提取2次，用時(shí)1 h。再將提取液在52℃下分餾出石油醚進(jìn)行回收，再用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)?jīng)轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心8 min取上清液，得到石油醚提取物。

1.2.2 測(cè)定內(nèi)容與方法。金銀花中對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素清除效果最佳的主要有效成分為綠原酸。本試驗(yàn)先制作綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

（1）綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作。參考李 坤等[18]、李耀倉(cāng)等[19]文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：稱(chēng)取1.0 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品與無(wú)水乙醇置于10 mL容量瓶中并搖勻，再?gòu)闹蟹謩e吸取 500、1 000、1 500、2 000、3 000 μL于另一10 mL容量瓶中，再用無(wú)水乙醇對(duì)綠原酸進(jìn)行定容。將不同濃度的綠原酸溶液分別裝入干凈的試管中并編號(hào)。調(diào)至綠原酸最大吸收波長(zhǎng)328 nm處測(cè)量吸光度，以5個(gè)不同濃度樣本的吸光度值為縱坐標(biāo)、以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

（2）綠原酸含量測(cè)定。取醇提法獲得的提取液1.5 mL（其對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的清除率最高），加入蒸餾水40 mL進(jìn)行稀釋后，采用紫外分光光度法對(duì)其吸光度值（OD328）進(jìn)行測(cè)定，并記錄數(shù)值。根據(jù)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，得出金銀花醇提物中主要有效成分綠原酸的含量。

1.2.3 金銀花提取物與細(xì)菌內(nèi)毒素的作用。分別取0.75 mL不同方法提取的金銀花提取液與0.75 mL細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（5 EU/mL）進(jìn)行混合后，放置于37℃溫育12 h，使3種金銀花提取物與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生作用，取出備用。

1.2.4 鱟試驗(yàn)（終點(diǎn)顯色法）檢測(cè)內(nèi)毒素清除效果。以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為基礎(chǔ)，通過(guò)鱟試驗(yàn)測(cè)定不同金銀花提取物對(duì)內(nèi)毒素的清除作用。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立。以15 EU/mL的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液為母液，用細(xì)菌檢查用水將其稀釋成0.10、0.25、0.5、1.0 EU/mL的濃度梯度。取無(wú)熱原試管，加入100 μL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、設(shè)計(jì)好的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品。再加入100 μL鱟試劑溶液，混勻后蓋上試管蓋，37℃溫育6 min。溫育結(jié)束后再加入100 μL顯色基質(zhì)溶液，混勻，37℃溫育6 min。溫育結(jié)束后向其加入500 μL偶氮化試劑1溶液，混勻；再加入500 μL偶氮化試劑2溶液，混勻；最后加入500 μL偶氮化試劑3溶液，混勻后靜置5 min。將分光光度計(jì)調(diào)至545 nm波長(zhǎng)處讀取待測(cè)樣本的吸光度值。以吸光度值作為縱坐標(biāo)、細(xì)菌內(nèi)毒素濃度作為橫坐標(biāo)建立內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

（2）鱟試驗(yàn)測(cè)定不同金銀花提取物對(duì)內(nèi)毒素的清除作用。3種提取方法所得到的金銀花提取液與細(xì)菌內(nèi)毒素作用后，參照鱟試劑說(shuō)明書(shū)，通過(guò)鱟試劑、顯色基質(zhì)反應(yīng)和偶氮化試劑的顏色反應(yīng)，測(cè)定水提取法、乙醇提取法、石油醚提取法所得提取物中內(nèi)毒素的殘留含量。根據(jù)以下公式得出3種提取物對(duì)內(nèi)毒素的清除率[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同金銀花提取物中綠原酸含量的測(cè)定結(jié)果

以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光值為縱坐標(biāo)、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖1所示。該曲線(xiàn)的回歸方程為y=0.032 5x-0.011 6，R2=0.999 8。

不同金銀花提取液中綠原酸的濃度如表1所示，金銀花水提取液、乙醇提取液、石油醚提取液中綠原酸含量分別為 11.536±0.036、12.347±0.099、11.752±0.047 μg/mL。結(jié)果表明，3種提取液中，乙醇提取液中綠原酸含量極顯著高于水提取液和石油醚提取液中綠原酸含量。

表1 不同金銀花提取物中綠原酸含量（n=3）

2.2 不同金銀花提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的清除率

以細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值作為縱坐標(biāo)、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作為橫坐標(biāo)，建立細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖3所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為y=0.88x+0.103 4，R2=0.998 3。測(cè)得陰性對(duì)照組吸光度平均值y=0.056，低于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最低點(diǎn)的y值，滿(mǎn)足試劑盒測(cè)定要求；同時(shí)，對(duì)供試品進(jìn)行干擾試驗(yàn)，測(cè)得供試品的回收率為98%，符合試劑盒說(shuō)明書(shū)中50%～200%的要求，因而在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。

3種提取方法得到的金銀花提取液與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌內(nèi)毒素作用后，進(jìn)行顯色基質(zhì)反應(yīng)和偶氮化試劑的顏色反應(yīng)。將水提取法、乙醇提取法、石油醚提取法提取物的吸光值代入回歸方程（y=0.88x+0.103 4），計(jì)算出3種提取液中內(nèi)毒素殘留量。結(jié)果表明，水提取液、乙醇提取液、石油醚提取液中內(nèi)毒素殘留量分別為 0.799±0.005、0.164±0.001、0.175±0.002 EU/mL。根據(jù)清除率方程計(jì)算，水提取液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的清除率為84.02%±0.10%，乙醇提取液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的清除率為96.71%±0.02%，石油醚提取液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的清除率為96.50%±0.04%（表2）。

表2 不同金銀花提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的清除作用（n=4）

3 結(jié)論與討論

細(xì)菌性腹瀉危及人和動(dòng)物的健康，導(dǎo)致劇烈腹瀉、多器官損傷和脫水。雖然可以通過(guò)抗菌藥物進(jìn)行治療，但伴隨抗菌藥物在臨床上長(zhǎng)期的廣泛使用，各種類(lèi)型的耐藥菌株也相繼產(chǎn)生。抗菌藥物在發(fā)揮治療作用而殺死細(xì)菌的同時(shí)，也會(huì)造成細(xì)菌內(nèi)毒素突然釋放，可能對(duì)人和動(dòng)物生命造成威脅[21]。在抗菌治療時(shí)降低細(xì)菌毒素的危害，對(duì)安全、有效地指導(dǎo)治療細(xì)菌性腹瀉具有重要意義。

本試驗(yàn)采用水提法、乙醇回流提取法、石油醚提取法得到3種金銀花提取物，測(cè)得綠原酸含量分別為 11.536±0.036、12.347±0.099、11.752±0.047 μg/mL。將3種金銀花提取物與5 EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌內(nèi)毒素作用12 h，通過(guò)鱟試驗(yàn)測(cè)定各提取物中殘留內(nèi)毒素的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水提取法、乙醇提取法、石油醚提取法所得提取物中殘留內(nèi)毒素的含量分別為0.799±0.005、0.164±0.001、0.175±0.002 EU/mL。 水提取液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的清除率為84.02%±0.10%，乙醇提取液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的清除率為96.71%±0.02%，石油醚提液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的清除率為96.50%±0.04%。由此表明，乙醇提取液對(duì)大腸桿菌內(nèi)毒素的清除作用最佳，其次為石油醚提取液和水提取液。

研究指出，金銀花水提物能夠破壞細(xì)菌內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)，從而起到抗炎作用；其中綠原酸為金銀花中主要抗菌成分，其對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素也有一定的對(duì)抗作用[22]。本試驗(yàn)采用鱟試驗(yàn)法篩選出的金銀花乙醇提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素清除效果最佳，并且乙醇提取物中綠原酸含量最高，這說(shuō)明金銀花中主要成分之一的綠原酸可能在細(xì)菌內(nèi)毒素清除方面發(fā)揮重要作用。

綜上所述，金銀花乙醇提取液對(duì)大腸桿菌內(nèi)毒素的清除效果最佳，其清除作用可能與金銀花乙醇提取物中較高的綠原酸含量有關(guān)，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。