基于流式細胞術的爪耳木染色體倍性與基因組大小測定

李英英 劉咲頔 王清隆* 王 鵬 王祝年

（1中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?71101；2中國熱帶農業科學院?？趯嶒炚?，海南海口 571101）

爪耳木（Lepisanthesunilocularis）為無患子科（Sapindaceae）鱗花木屬（Lepisanthes）常綠灌木[1]，為國家二級重點保護野生植物和海南特有滅絕級植物[2-3]。1935年爪耳木消失在人們視野，2013年人們再次發現爪耳木身影，時間跨度近80年[4]。爪耳木耐旱、耐瘠薄，是海南熱帶濱海植被中為數甚少的喬木樹種之一，是海南濱海地區較理想的造林樹種[5]。爪耳木根可入藥，具有一定的藥用和經濟價值[6]。目前，關于爪耳木基因組學的研究鮮報道，這導致爪耳木的研究和利用受到制約。

流式細胞術是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術。流式細胞術是單克隆抗體及免疫細胞化學技術、激光和電子計算機科學等高度發展及綜合利用的高技術產物[7]，是測定基因組大小的常用方法。目前，流式細胞術已應用在芭蕉、旱柳、玫瑰茄、紅麻等植物基因組大小測定上[8-11]。本研究利用流式細胞術對爪耳木進行染色體倍性測定和基因組大小評估，以期為爪耳木的基因組學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于流式細胞術分析的爪耳木葉片采自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所農業部儋州熱帶藥用植物種質資源圃（東經 109°50′09″、北緯19°51′09″），葉片采摘后置于 4 ℃冰箱中保存。

內參植物選擇橡膠7-33-97和大豆williams82的新鮮葉片，橡膠7-33-97采于海南儋州橡膠種植圃，基因組大小為1.46 GB[12]；大豆williams82由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所提供，基因組大小1.12 GB[13]。橡膠新鮮葉片采摘后存于4℃冰箱；大豆williams82為種子苗，置于光照培養箱中培養。

1.2 試驗藥品與儀器

供試藥品：PI溶液20 mg/L、DAPI溶液 20 mg/L、WPB解離液、GLB解離液等。

供試儀器：流式細胞儀、培養皿、鑷子、刀片、漏斗、試管等。

1.3 試驗方法

本試驗用爪耳木初生葉、幼葉、成葉以及橡膠7-33-97嫩葉、大豆williams82嫩葉，用流水反復沖洗3～5次，每次30 s，將葉片表面完全洗凈后用衛生紙擦干，留待試驗取用。分別用WPB解離液和GLB解離液解離這些葉片，篩選合適的解離液。使用DAPI溶液20 mg/L染色，利用流式細胞儀在UV光線下檢測基因組倍性。使用PI溶液20 mg/L染色，利用流式細胞儀在632 nm頻率下檢測基因組大小。

1.3.1 爪耳木染色體倍性檢測。①取材：取指甲蓋大小的爪耳木初生葉、幼葉、成葉及橡膠嫩葉、大豆嫩葉分別置于培養皿中，培養皿放在冰袋上。②解離：在培養皿中分別加入WPB解離液500～800 μL和GLB解離液500～800 μL，以稍微浸沒葉片為宜，用刀片垂直將葉片切碎，讓葉片碎片充分浸沒在解離液中。③染色：提前將DAPI染液2 mL加入試管中，將解離2～3 min后的樣品連同解離液通過漏斗分別加入試管中，將試管置于避光處染色20 min。④上機：上機前充分吹打混勻試管，激光選擇UV檔位，調整參照植物大豆樣品峰的位置，位置確定后保持各項設置不變，暫停程序后更換待測樣本，檢測待測樣本的樣品峰位置，以此計算出待測植物的倍性（待測植物倍性=待測植物樣品峰位置/參照植物樣品峰位置×參照植物倍性）。每次更換待測樣本前用超純水清洗機器。⑤數據選擇和保存：調整參照植物樣品峰位置。檢測完畢后用專用清洗液清洗，清洗后關機。

1.3.2 爪耳木基因組大小檢測。①取材：取指甲蓋大小的爪耳木初生葉、幼葉、成葉及橡膠嫩葉、大豆嫩葉分別置于培養皿中，培養皿放在冰袋上。②解離：在培養皿中分別加入WPB解離液500～800 μL和GLB解離液500～800 μL，以微微浸沒葉片為宜，用刀片垂直將葉片切碎，讓葉片的碎片充分浸沒在解離液中。③染色：提前在試管中加入PI染液2 mL，將解離2～3 min后的樣品連同解離液通過漏斗分別加入試管中，將試管置于避光處染色20 min。④上機：上機前充分吹打混勻試管，激光選擇632 nm波長。檢測參照植物，待出現明顯的樣品峰后通過調整電壓等方式調整樣品峰在橫坐標上的位置，確定好位置后保持設定不變，暫停程序后更換待測樣本，計算基因組大?。ù郎y植物基因組大小=待測植物樣品峰位置/參照植物樣品峰位置×參照植物基因組大小）。每次更換待測樣本前用超純水清洗機器。⑤數據選擇和保存：框選樣品峰，將變異系數控制在5%以下，待檢測到的具有熒光信號的細胞核超過2 000個后，可暫停程序，保存數據。檢測完畢后用專用的清洗液清洗，清洗后關機。

2 結果與分析

2.1 爪耳木染色體倍性分析

通過調整流式細胞儀的設置，使大豆williams82樣品峰的位置穩定在橫坐標上四格的位置（圖1），待樣品峰基本穩定后，暫停程序，保持設定不變，用超純水清洗上樣口。之后上機爪耳木的待測樣本，結果見圖2。爪耳木的樣品峰位置與對照樣品大豆williams82的位置十分接近。大豆williams82為二倍體，因而推測爪耳木基因組倍性與大豆williams82相同，也為二倍體。

2.2 爪耳木基因組大小鑒定

圖3為大豆williams82的PI熒光強度分布情況。于流式細胞儀上框選明顯的樣品峰，取具有熒光的細胞核數超過2 000個、變異系數低于5%的數據，以此保證數據的準確性。大豆平均值為17 012.71，變異系數為4.2%。圖4為橡膠7-33-97的PI熒光強度分布情況，框選的樣品峰平均值為21 472.6，變異系數為3.42%。圖5為爪耳木的PI熒光強度分布情況，樣品峰平均值為13 765.81，變異系數為4.42%。

依據大豆williams82基因組大小為1.12 GB，預測爪耳木基因組大小為906.24 Mb；依據橡膠7-33-97的基因組大小為1.46 GB，預測爪耳木基因組大小為935.99 Mb。因此，以大豆williams82和橡膠7-33-97作為參照的爪耳木基因組大小約為921.11 Mb。

3 結論與討論

基于流式細胞術的染色體倍性和基因組大小測定結果表明，爪耳木為二倍體植物，基因組大小約為921.11 Mb。較高的重復序列比例和較低的雜合率說明爪耳木在基因型頗為偏向純合的同時也有不小的突變概率。由于爪耳木為極小種群，種群內基因頻率較低，加之本身基因型偏向純合，一旦在遺傳發育過程中發生基因突變或沉默、缺失，爪耳木就很難恢復到之前的狀態，這也可能是之前爪耳木瀕臨滅絕的直接原因。