王正和 馮勇軍 吳李仲 吳祥基

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）起源于鼻咽上皮細胞，轉移性強，惡性化程度高[1-2]。鑒定潛在的生物標志物對其診治至關重要，表觀遺傳學改變已被報道為惡性腫瘤中重要的致癌機制之一，在NPC發展的早期階段即能檢測到某些抑癌基因啟動子過度甲基化[3]。來源于腫瘤細胞的循環游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）具有腫瘤特性，為NPC 的早期診斷提供了有價值的信息。在既往的研究中，Zhao 等[4]利用甲基化捕獲測序和cDNA 微陣列技術獲得NPC 組織全基因組甲基化譜，提供了關于癌癥特異性異常甲基化的有用信息。其中RAS 樣雌激素調節生長抑制劑（RAS-like estrogen-regulated growth-inhibitor，RERG）、鋅脂蛋白（zinc finger protein 671，ZNF671）編碼基因是NPC 中常見甲基化的主要腫瘤抑制基因[5-6]。目前尚不清楚這些基因的甲基化狀態是否可用于早期NPC 的診斷，因此本研究檢測了RERG 和ZNF671在血漿cfDNA及腫瘤組織中的甲基化情況，以評估其作為潛在的NPC 診斷生物標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2020年2月至2021年3月瓊海市人民醫院經病理診斷且未治療的NPC 患者106 例（NPC 組），男性66 例，女性40 例，年齡22～75 歲，平均年齡（52.11±12.28）歲。臨床分期I 期25 例，Ⅱ期81 例。其中101 例患者為非角化型癌。納入標準：1）符合NPC 診斷標準[7]，并經活檢病理學檢查確診；2）初治患者，活檢前未接受過放化療。排除標準：1）合并其他部位惡性腫瘤、嚴重心、肺、腎、肝嚴重功能障礙者；2）入組前1 個月內有大型手術史或嚴重創傷者。對照組分為兩組：1）正常對照組：本院進行體格檢查的150 例健康志愿者［男性91 例，女性59 例，年齡18～79 歲，平均年齡（51.21±13.10）歲］；2）良性對照組：100 例經活檢病理診斷為鼻咽部慢性黏膜炎的患者［男性60 例，女性40 例，年齡18～73 歲，平均年齡（51.44±12.89）歲］，排除惡性腫瘤、其他炎癥相關疾病和家庭腫瘤疾病史者。3 組受試者年齡、性別、居住地、吸煙史等一般資料比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），具有可比性。本研究為前瞻性隊列觀察研究，研究方案以及其中所涉及到的組織、血液樣本、患者病歷資料的使用資質均通過了本院倫理審查委員會的批準（編號：2020012），研究中的操作均符合操作規范，所有受檢者均提供書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本獲取 血液樣本：NPC 組、良性對照組患者于手術當天以及正常對照組在入組時采集清晨空腹外周靜脈血5 mL，均置于乙二胺四乙酸抗凝管中，1 600 r/min，10 min，離心2 次，分離留取血漿，置于-80℃冰箱中儲存待測。組織樣本：將手術切除的NPC 組織使用生理鹽水清洗，置入液氮中速凍。1 h 后儲存于-80℃環境中保存，剩余樣本使用福爾馬林固定、石蠟包埋，制成4 μm 的連續切片，用于病理檢查或免疫組織化學分析。

1.2.2 血漿cfDNA 及組織DNA 提取使用QIAamp DNA Blood Mini Kit（德國Qiagen 公司）試劑盒提取血漿cfDNA。用2100 型生物分析儀系統與高靈敏度DNA 試劑盒分析血漿cfDNA 濃度，采用75～250 bp 血漿cfDNA 進行后續檢測；取出-80℃冰箱中的組織樣本，根據DNeasy Tissue Kit 試劑盒（德國Qiagen 公司）的操作說明提取DNA。使用 Epi-Tect Bisulfite Kit 試劑盒（德國Qiagen 公司）將上述組織DNA 及血漿cfDNA 使用甲基化敏感和（或）甲基化依賴的限制性內切酶進行處理分離。

1.2.3 甲基化特異性PCR（methylation specific PCR，MSP） 使用組織DNA（250 ng）或血漿cfDNA 洗脫液（45 μL）分析6 個基因，其中包括4 個候選基因、2個質控基因。同時建立SEC、DEC 限制性內切酶酶切效率測試系統，應用處理的DNA 作為PCR 擴增模板，使用PyroMark PCR 試劑盒（德國Qiagen 公司）進行。在NCBI 基因組數據庫獲取RERG、ZNF671 基因序列，采用MethPrimer 軟件設計MSP 引物，RERGFor：5’-GGAGTTTGGAGGTTTGGAAAT-3’，RERGRev：5’-CAAAAACAAATACCAATAACCC-3’；ZNF 671-For：5’-GAATTTAGGTTAGGGATAGTTTGAT-3’，ZNF671-Rev：5’-CCAAAAAAAAAATATTTCAATAC C-3’。擴增熱循環步驟：95℃初始變性10 min；95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環；最終72℃延伸10 min。每個樣本平均進行3 次平行PCR 檢測。擴增產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳分離基因條帶，焦磷酸測序使用PyroMark Assay Design Software 2.0（德國Qiagen 公司）進行。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析。計數資料以χ2檢驗，年齡等正態分布計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析；基因甲基化程度不符合正態分布，以M50（四分位值）表示，進行非參數檢驗。采用Kappa 一致性檢驗分析NPC 組患者血漿cfDNA 與組織中RERG、ZNF671 基因啟動子甲基化狀態的相關性。使用受試者工作特征（ROC）曲線評估血漿cf-DNA RERG、ZNF671 啟動子甲基化狀態對NPC 早期診斷的價值。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組受試者血漿cfDNA 中RERG、ZNF671 啟動子甲基化狀態比較

經MSP 法檢測，NPC 組患者的血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動子甲基化率及甲基化程度均顯著高于良性及正常對照組受試者，差異具有統計學意義（均P＜0.05，表1，圖1）。

表1 3 組受試者血漿cfDNA 中RERG、ZNF671 啟動子甲基化狀態分析 例（%）

2.2 NPC 組患者血漿cfDNA 與組織中RERG、ZNF671 基因啟動子甲基化狀態的相關性分析

NPC 組患者的組織DNA 與血漿cfDNA RERG啟動子甲基化率（45.28%vs.38.68%）檢驗的Kappa值為0.788（P＜0.001），而ZNF671 啟動子甲基化率（55.66%vs.48.11%）檢驗的Kappa 值為0.791（P＜0.001）。組織與血漿cfDNARERG、ZNF671 啟動子甲基化率檢驗結果的Kappa 值為0.6～0.85，認為一致性較好。

2.3 NPC 組患者血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動子甲基化狀態與臨床病理特征的關系

T 分期為Ⅱ期的NPC 組患者RERG 和ZNF671基因啟動子甲基化率更高（P＜0.05）；同時艾巴氏病毒（Epstein-Barr virus，EBV）衣殼抗原（viral capsid antigen，VCA）-IgA 為1∶80、EA-IgA 為≥1∶40、EBV DNA≥121.90 copy/mL 的NPC 組患者RERG 啟動子甲基化率也較高（P＜0.05，表2）。

表2 NPC 組患者血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動子甲基化狀態與臨床病理特征的關系 （續表2）

表2 NPC 組患者血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動子甲基化狀態與臨床病理特征的關系 例（%）

2.4 ROC 曲線分析血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動子甲基化程度對NPC 的早期診斷價值

血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動子甲基化狀態聯合診斷NPC 的曲線下面積為 0.981（95%CI：0.971～0.992 ），顯著高于常規腫瘤標志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）單獨診斷的AUC（Z=-3.995，P=0.003，表3，圖2）。

表3 血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動子甲基化程度對NPC 的診斷價值

3 討論

NPC 早期無明顯臨床癥狀，致使大部分新診斷患者已發展至局部晚期或存在頸部淋巴結轉移，早期診斷難度較大[8-9]。基于Zhao 等[4]研究，本研究通過MSP 法 檢 測 了cfDNA 中2 個 候 選 基 因（RERG、ZNF671）以及組織DNA 的甲基化率，以評估其作為NPC 篩查的前瞻性生物標記物，結果顯示血漿cf-DNA 中RERG、ZNF671 啟動子甲基化率顯著升高，表明這些候選基因有助于NPC 的早期診斷。

血漿cfDNA 也被稱作“液體活檢”，廣泛存在于血液、尿液、糞便及多種體液中，細胞凋亡、壞死或主動分泌都可釋放血漿cfDNA，并攜帶來自腫瘤源細胞的DNA 甲基化、基因組變異等信息。血漿cfDNA在癌癥疾病進展階段具有早發性、特異性，結合DNA甲基化等表觀遺傳改變的分析可能實現對于癌癥的早期診斷[10-12]；相較于組織活檢更為便捷、經濟高效，同時屬于微創檢測，更便于對癌癥患者進行實時監測。本研究中NPC 組患者的組織DNA 與血漿cfDNA RERG/ZNF671 啟動子甲基化率檢驗的Kappa 值均在0.6～0.85，檢驗結果一致性較好，但血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動子甲基化率均小于組織，可能與血漿cfDNA 不僅來自NPC 細胞，還來自正常細胞有關。

RERG 是多種致癌途徑的抑制因子，其于2001年通過微陣列分析首次被鑒別。RERG 在乳腺癌細胞中過表達，可使腎素血管緊張素系統/絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶信號通路失活，進而抑制癌細胞增殖、遷移、侵襲，然而當RERG 在乳腺癌組織中表達降低時，往往與乳腺癌患者的不良預后相關[13]。還有學者認為RERG 高表達與惡性胸膜間皮瘤女性術后獲得更長的生存時間相關[14]，與細胞周期和整聯蛋白相關的幾個通路被下調有關。RERG 高表達可能反映了與惡性胸膜間皮瘤上皮-間質轉化相關的“組織分子梯度”上皮部分，因此具有更有利的臨床結局。ZNF671 是哺乳動物轉錄抑制因子鋅脂蛋白家族的成員，具有調節癌細胞分化、增殖、凋亡、侵襲、轉移及轉化的作用。Zhan 等[15]認為過表達可以抑制Wnt/βcatenin 信號通路，進而抑制肺癌細胞的增殖和轉移。Xu 等[16]也證實在NPC 組織中RERG、ZNF671 啟動子甲基化率更高，同時聯合RERG、ZNF671 啟動子甲基化率進行早期診斷具有更佳的準確性。上述分子機制也進一步支持了本研究結果。本研究經ROC 曲線分析，血漿cfDNA RERG 和ZNF671 聯合診斷價值也優于常規腫瘤標志物CEA，因此檢測血漿cfDNA有望成為NPC 早期診斷的候選方法。

綜上，RERG、ZNF671 啟動子甲基化率在NPC患者血漿cfDNA 和腫瘤組織中均普遍升高，聯合檢測血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動子甲基化狀態對NPC 診斷顯示出較高的臨床價值。盡管本研究存在樣本量小的局限性，但結果提示血漿cfDNA RERG、ZNF671 甲基化率的組合有望成為基于社區人群NPC 篩查的候選生物標志物。