尿苷胞苷激酶2調控肺腺癌發生發展的機制研究

許 楊，劉 黎，王李杰，楊旭輝，霍 苗

1 解放軍戰略支援部隊特色醫學中心 呼吸內科，北京 100101；2 解放軍總醫院第一醫學中心 腫瘤內科，北京 100853

肺癌是世界上病死率最高的癌癥之一，肺癌患者診斷時大多處于癌癥晚期，長期生存率非常低，預后極差[1-3]。肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)是肺癌中占比最大的分型。雖然近年來LUAD診斷和預后相關技術不斷被報道，但其5年生存率仍只有15%左右[4-5]，所以探索新的LUAD早期診斷和預后相關生物標志物十分重要。 尿苷-胞苷激酶(uridine-cytidine kinase，UCK)是嘧啶核苷酸生物合成中的一種重要的限速酶，其中UCK2發揮的催化活性最強[6]。研究在多種腫瘤中發現了UCK2過度表達，包括胰腺腫瘤、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌等[7-10]。雖然UCK2在肺癌中的作用已有初步研究，但UCK2在LUAD發生發展中的作用及其調控機制研究未見報道。本研究旨在探索UCK2在LUAD發生發展中的作用及可能調控機制，為LUAD的診斷和治療提供新的思路。

材料與方法

1實 驗 材 料 和 分 組 人LUAD細 胞A549和Calu3、Flag-UCK2質粒由解放軍總醫院腫瘤醫學部研究所保存。RPMI 1640培養基和胎牛血清購自賽默飛世爾公司；Flag-HRP、β-actin、UCK2、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR抗體購自西格瑪奧德里奇貿易有限公司。葡萄糖攝取比色檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒、ATP比色檢測試劑盒購自博愛新開源生物科技有限公司。生長和遷移實驗設置兩組：對照組(轉染Flag)；實驗組(轉染Flag-UCK2)。mTOR通路的相關Western blot驗證及糖攝取、ATP和乳酸測定設置四組：1)EV + DMSO組；2)UCK2 + DMSO組；3)EV + 雷帕霉素組；4)UCK2 + 雷帕霉素組。

2TCGA數據下載及分析 從癌癥基因組圖譜數據庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫中獲取LUAD的相關數據，包括轉錄組數據和臨床數據。利用Sangerbox中的DECenter插件對LUAD和癌旁組織進行差異分析，得到差異基因制作熱圖和火山圖。用RStudio軟件對數據進行分析，利用Survival包進行獨立預后分析，P＜0.05認為基因與LUAD預后有相關性。利用Survival ROC包進行基因預測準確性分析，AUC＞0.7認為基因對LUAD預后預測的準確性更好。利用http://kmplot.com在線分析UCK2基因在LUAD中的總生存時間(overall survival，OS)和無病生存期(disease-free survival，DFS)，P＜0.05認為有意義。UCK2在LUAD的癌和癌旁表達及各分期表達利用GraphPad Prism 8分析，P＜0.05認為有意義。

3細胞轉染和Western blot印跡實驗 A549和Calu3細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養基于37℃、5% CO2孵箱中培養。參照Vigofect轉染試劑說明書配置轉染液。6 h后更換培養基。24 h后每組收取部分細胞，加入細胞裂解液裂解后，加SDS，煮樣后行凝膠電泳。分別孵育Flag抗體和β-actin抗體。發光液壓片顯影。

4CCK-8實驗 分別將待檢測的A549和Calu3細胞系的對照組和實驗組細胞分別充分吹勻后，以3000/孔的細胞密度接種于96孔板，每個實驗分組鋪設15個孔。參照CCK-8使用說明分別在第0、1、2、3、4天檢測細胞增殖活力。待測細胞加入CCK-8混合液1 h充分作用后，上機測定OD值(波長450 nm)。

5劃痕試驗 轉染的細胞取出吹勻后鋪于6孔板中，以200 μL槍頭垂直在鋪滿細胞的培養皿上劃痕，加入PBS緩沖液，去除劃下的細胞，棄PBS緩沖液，加入無血清培養基。分別于0 h和24 h在顯微鏡下拍照、標記和記錄。

6基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA) TCGA數據庫中LUAD轉錄組數據按照UCK2表達數據分為高表達組和低表達組，用GSEA分 析 軟 件 對C6:oncogenic signatures基因集進行分析，分析的基因集合排列數為1000個，表型標簽為UCK2的表達水平。P＜0.05和FDR-q＜0.05的基因集被認為是顯著富集。

7糖攝取、ATP和乳酸測定 按照葡萄糖攝取比色分析試劑盒說明書，將待測細胞棄培養基后，加入100 μL的KRPH buffer孵育40 min，添加10 mmol/L的2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)孵育20 min，置于85℃ 40 min，冰上5 min，加入中和液12 μL，離心后取上清，酶標儀412 nm檢測OD值。按照ATP比色分析試劑盒說明書，待測細胞加入100 μL ATP assay buffer，冰 上 裂解10 min，離心。按說明書操作，最后獲得待測終液。酶標儀設定為570 mm檢測OD值并記錄。按照乳酸分析試劑盒說明書，待測細胞加入50 μL Lactate assay buffer，冰上裂解10 min，按說明書操作，最后獲得待測終液。酶標儀設定為450 nm檢測并記錄。

8統 計 學 方 法 統 計 分 析 使 用SPSS24.0軟 件。正態分布的計量數據組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，非正態分布數據比較采用秩和檢驗。UCK2對細胞增殖和遷移能力的影響分析采用重復測量方差分析。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，癌旁基因預測LUAD的能力評估采用ROC曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1UCK2在LUAD組 織 中 的 表 達 為 了 篩 選 與LUAD生長相關的基因，將TCGA數據庫LUAD樣本的正常組織與腫瘤組織表達數據進行差異分析。對19 497個編碼蛋白的基因進行分析，其中1 830個上調基因，2 725個下調基因(圖1A)。對這些差異基因進行單因素獨立預后分析，篩選了49個與預后相關的基因。結合臨床數據，對這49個基因進行多因素分析，其中與腫瘤的大小、淋巴結轉移、遠處轉移相關的基因共10個(表1)。利用受試者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線進一步進行篩選對LUAD預后有較好預測水平的基因，其中AUC值大于0.7的只有UCK2(表2)。

圖1 UCK2促進LUAD的發展，與較差的預后呈正相關(bP＜0.01)A：火山圖顯示正常組織與腫瘤組織之間RNA-seq分析的差異調節基因表達。上調和下調的基因分別以紅色和綠色顯示。餅圖顯示共有19 497個基因表達，其中1 830個基因上調，2 725個基因下調；B ~ C：乘積極限法(Kaplan-Meier)分析TCGA中LUAD患者的DFS和OS；D：UCK2在正常組織與腫瘤組織之間的表達差異；E：小提琴圖顯示了UCK2在LUAD 1 ~ 4期表達水平，并使用單因素方差分析進行比較Fig.1 UCK2 was screened out as a promoter in LUAD and positively correlated with poorer prognosis (bP＜0.01)A: The volcano plot illustrating differentially regulated gene expression from RNA-seq analysis between the normal and tumor tissues.Genes upregulated and downregulated are shown in red and green, respectively. Values are presented as the log10 of tag counts. The pie chart revealed a total of 19 497 genes expressed, of which 1 830 genes were upregulated and 2 725 genes were downregulated; B, C:Kaplan–Meier estimates of disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) of LUAD patients from TCGA; D, E: UCK2 expression scores between normal and tumor tissues, stage 1-4 were displayed in violin plot and compared using one-way Anova

表1 LUAD癌與癌旁的差異基因與臨床性狀的關系(P)Tab. 1 Relationship between DEGs and clinical traits in LUAD (P)

表2 LUAD癌與癌旁差異基因的AUC值Tab. 2 AUC values of DEGs in LUAD

TCGA數據庫中LUAD的相關數據分析結果顯示，UCK2的高表達與不良的DFS(P=0.022)和OS(P＜0.01)相關(圖1B ~ 圖1C)。UCK2的表達量在LUAD組織中高于癌旁組織(P＜0.01；圖1D)，且隨著分期的上升，UCK2表達水平也上調(P＜0.01；圖1E)。綜上，UCK2可能作為一個正調控基因參與LUAD的發生發展。

2UCK2促進A549和Calu3細胞的生長 Western blot實驗結果顯示，在A549和Calu3細胞中轉染Flag和Flag-UCK2，內參β-actin表達水平一致，轉染Flag-UCK2的細胞樣品在29 kU檢測到特異性條帶。CCK-8實驗結果顯示，與Flag組相比，A549細胞中Flag-UCK2組從第2天起增殖能力顯著增加(t=3.733、5.856、7.421，P=0.02、0.004、0.002，n=3；圖2A)，Calu3細胞系中，Flag-UCK2組從第3天起增殖能力顯著增加(t=4.788、9.941，P=0.009、0.001，n=3；圖2B)。

圖2 UCK2促進A549(A)和Calu3(B)細胞的生長能力[aP＜0.05, bP＜0.01, vs Flag (1)組]Fig.2 UCK2 promotes the growth of A549 (A) and Calu3 (B) cells (aP＜0.05, bP＜0.01, vs Flag [1] group)

3UCK2促進A549和Calu3細胞的遷移能力和Flag組比，Flag-UCK2組的A549細胞24 h遷移能力明顯增加(t=8.947，P=0.001，n=3；圖3A)。同樣，Calu3細胞系中，Flag-UCK2組24 h遷移能力亦明顯增加(t=20.102，P＜0.001，n=3；圖3B)。以上結果表明，UCK2對A549和Calu3細胞的遷移能力正向調控。

圖3 UCK2促進A549(A)和Calu3(B)細胞的遷移能力[bP＜0.01, cP＜0.001, vs Flag (1)組]Fig.3 UCK2 promotes the migration of A549 (A) and Calu3 (B) cells (bP＜0.01, cP＜0.001, vs Flag [1] group)

4UCK2在LUAD中正向調控mTOR通路 為進一步深入研究UCK2的分子調控機制，利用GSEA分析發現，低表達的UCK2與LUAD良好預后相關(P＜0.001；圖4A)，高表達的UCK2與mTOR上調基因集呈正相關(P=0.002；圖4B)，低表達的UCK2與mTOR下調基因集呈正相關(P=0.004；圖4C)。這些結果提示在LUAD中UCK2與mTOR通路關系密切。

圖4 UCK2在LUAD中正向調控mTOR通路A：GSEA分析顯示UCK2的低表達與LUAD患者的良好預后相關；B、C：UCK2表達與LUAD數據集中的mTOR通路呈正相關Fig.4 UCK2 positively regulates mTOR pathway in human lung adenocarcinoma A: GSEA plot showed that low expression of UCK2 was associated with good prognosis in LUAD patients; B, C: UCK2 expression was positively correlated with mTOR signaling in the LUAD dataset

5UCK2促進A549細胞中mTOR通路的激活為了研究UCK2與mTOR通路的關系，我們使用了mTOR通路特異性抑制劑—雷帕霉素來進一步驗 證。Western blot實 驗 證 明，UCK2過 表 達 組(2)與EV + DMSO組(1)比較，mTOR通路中的關鍵蛋白p-PI3K(P＜0.001)、p-AKT(P＜0.001)、pmTOR(P＜0.001)上調。雷帕霉素組(3)降低了這些蛋白的表達(P＜0.001)，而UCK2 + 雷帕霉素組(4)顯示，UCK2對mTOR通路中關鍵蛋白的上調作用被逆轉(P＜0.001)。以上結果證明UCK2正調控LUAD中mTOR通路(圖5)。

圖5 UCK2促進A549細胞中mTOR通路的激活[cP＜0.001, vs EV + DMSO (1)組]Fig.5 UCK2 activates the mTOR pathway in A549 cells (cP＜0.001, vs EV + DMSO [1] group)

6UCK2促進A549細胞中糖攝取、乳酸和ATP Warburg效應是腫瘤細胞的生長重要的現象，我們通過測定LUAD細胞的糖攝取、乳酸和ATP，以驗證UCK2對LUAD細胞的生長調控作用。結果顯示與EV + DMSO組(1)比較，過表達UCK2組(2)的糖攝取(P＜0.001)、乳酸(P＜0.001)和ATP(P=0.004)均上調，這與前期UCK2促進腫瘤細胞生長的結果一致。雷帕霉素組(3)降低了糖攝取(P＜0.001)、乳酸(P＜0.001)和ATP(P= 0.003)水平，UCK2 + 雷帕霉素組(4)結果顯示，雷帕霉素逆轉了UCK2對糖攝取(P＜0.001)、乳酸(P＜0.001)和ATP(P＜0.001)的上調作用(圖6A ~ 圖6C)。

圖6 UCK2促進A549細胞中糖攝取、乳酸和ATP [bP＜0.01, cP＜0.001, vs EV + DMSO (1)組]Fig.6 UCK2 activates the mTOR pathway in A549 cells (bP＜0.01, cP＜0.001, vs EV + DMSO [1] group)

討 論

LUAD在非小細胞肺癌中是最常見的組織學亞型，盡管外科手術、放化療、靶向治療及免疫治療近年來取得了一定進展，但患者的存活率仍不高。新治療靶點的尋找和機制研究仍是LUAD的研究重點。

UCK在核苷類似物的磷酸化中發揮著重要作用。UCK2 催化尿苷和胞苷核苷酸的磷酸化。同時還催化某些細胞毒性核糖核苷類似物的磷酸化[11]。以往的研究表明UCK2在多種腫瘤中過度表達，其表達水平對于腫瘤發生發展具有一定的預測價值。然而，UCK2在LUAD中的作用尚不清楚。本研究中，我們通過對TCGA數據庫中LUAD的相關數據進行分析發現，UCK2是LUAD癌和癌旁的差異基因，并且對LUAD患者的DFS和OS具有良好的預測特性。我們進一步發現分期較晚患者的樣本中UCK2表達水平更高。我們在A549和Calu3兩種LUAD細胞中進行了細胞增殖和劃痕實驗，結果證實過表達UCK2明顯增加LUAD細胞的增殖和遷移能力。這些結果提示UCK2在調節LUAD的生長和進展中可能發揮著促癌作用。UCK2可能是LUAD的生物標志物和潛在治療靶點。

mTOR信號通路在腫瘤發展過程中起著重要作用[12-14]。該通路的激活與腫瘤的發生、進展及轉歸密切相關。mTOR通路抑制劑不斷地被開發應用于腫瘤的治療中[15-18]。而且，mTOR通路抑制劑對于改善免疫治療相關不良事件也發揮了重要作用[19-20]。在本研究中，我們首先利用TCGA數據庫中LUAD的RNA-seq數據進行GSEA富集分析，發現UCK2與mTOR通路密切相關。在細胞水平，與空白組比較，過表達UCK2組p-PI3K、p-AKT、p-mTOR均顯著上調。表明過表達UCK2可能通過上調PI3K/AKT/mTOR信號通路促進A549細胞增殖和遷移。為了驗證這一結果，我們設置了mTOR通路的抑制劑—雷帕霉素進行干預。結果表明，雷帕霉素組降低了p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達，而UCK2和雷帕霉素共同干預組結果表明，UCK2對mTOR通路中關鍵蛋白的上調作用被雷帕霉素逆轉。糖攝取、乳酸和ATP測定也得到了同樣的結果。再次證明過表達UCK2可能通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進LUAD的生長和侵襲。

綜上所述，我們的研究結果表明過表達UCK2在LUAD生長和遷移中發揮重要作用，這可能是通過激活mTOR通路來實現的。UCK2在LUAD中的具體作用機制值得進一步深入研究。