人GFP-Sp1基因真核表達載體的構建及其對細胞周期調控作用研究

崔瀛書，孫園園，龍 珊，徐媛媛，李 怡1,，胡 佳，李 倩，李曉松

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第七醫學中心 腫瘤內科，北京 100700；3 解放軍總醫院第一醫學中心 激光科，北京 100853

特 異 性 蛋 白1(specificity protein 1，Sp1)是Sp/XKLF家族中第一個被鑒定和表征的轉錄因子，具有廣泛而重要的生物學功能[1]。它與富含GC 的序列結合，參與調節生物體內許多基因的表達，這些基因涉及細胞生命的許多方面，如代謝、細胞生長分化、血管生成和細胞凋亡調節[2-4]。研究表明，Sp1在許多惡性腫瘤中處于高表達的狀態，如甲狀腺癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質母細胞瘤、肺癌和胃癌[3,5-6]。在已收集或建立的患者樣本和腫瘤模型中，Sp1表達水平與腫瘤分期、侵襲潛力和患者生存率密切相關，高水平的Sp1常預示著患者預后不良[7]。因此，許多研究探討了靶向 Sp1治療腫瘤或使腫瘤對其他治療敏感的可能性[8-9]。Sp1表達水平在整個細胞周期中受到嚴格調節，以實現細胞有限增殖繼而衰老[10-11]。若Sp1水平發生紊亂，細胞則能夠克服增殖障礙，進而導致腫瘤發生。研究表明Sp1在一般條件下與p21或細胞周期依賴激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)形成復合物，不僅調控Sp1介導的下游基因，同時可通過一些修飾如磷酸化等改變Sp1自身活性與表達水平[12]。本研究擬通過構建Sp1真核表達載體，轉染入人乳腺癌細胞ZR75-1中實現過表達Sp1，之后通過免疫熒光定位、逆轉錄PCR等進一步研究Sp1在乳腺癌細胞中對細胞周期相關基因表達水平的影響，為后續深入探索Sp1在乳腺癌細胞周期中的作用奠定基礎。

材料與方法

1實驗材料 人乳腺癌ZR75-1細胞購買于武漢普諾賽生命科技有限公司，載體pEGFP-C1購買于北京義翹神州科技股份有限公司，人乳腺文庫模板由解放軍總醫院腫瘤實驗室提供；上、下游引物由北京博邁德公司合成；限制性核酸內切酶(XhoⅠ和EcoRⅠ)、PCR混合試劑、Taq酶、T4連接酶等克隆試劑購買于北京索萊寶科技有限公司；Vigofect轉染試劑購自威格拉斯生物技術(北京)有限公司；細胞DMEM培養基與胎牛血清購買于浙江天杭生物科技有限公司；免疫熒光試劑盒購買于北京奧科生物技術有限公司；基因序列測序由北京博邁德科技發展有限公司完成；GFP抗體、β-actin抗體購買于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗購買于武漢三鷹生物技術有限公司。

2pEGFP-Sp1重組質粒的構建及測序 以人乳腺文庫為模版，通過NCBI網站查找目的基因Sp1的CDS區序列，根據序列設計上游引物：5'-CCGCTCGAGCTATGAGCGACCAAGATCACT -3'，下游引物：5'- CGGAATTCTCAGAAGCCATTGCCACTG -3'。以上、下游引物和人乳腺文庫為模板進行Sp1基因擴增，設定程序：95℃，預變性5 min；95℃變性30 s，57℃，退火30 s，72℃，延伸3 min 30 s，30個循環；72℃，延長7 min。將PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察位置條帶是否與預測一致，若一致則進行回收。將回收產物與pEGFP-C1空載體進行XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，將上述酶切產物進行T4酶連4 h以上(16℃)，將連接產物轉化入DH5α后涂板，10 h后選擇克隆菌落進行菌液PCR，選取其中的陽性克隆菌落搖菌并提取質粒，提取質粒后用XhoⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定。酶切后出現兩條特異性條帶，即鑒定正確，將該克隆送往北京博邁德科技發展有限公司進行測序。

3Western blot驗證Sp1蛋白的表達 將處于半對數生長期的乳腺癌ZR75-1細胞接種于2個6 cm皿中，細胞生長總面積約占每個細胞培養皿的80%，待細胞貼壁后進行轉染。首先將4 μL Vigofect轉染試劑與196 μL 0.9%氯化鈉注射液置于EP管中，混合均勻后，靜置5 min；將10 μg pEGFPSp1重組質粒或pEGFP-C1空載體用0.9%氯化鈉注射液補齊至200 μL，移液槍吹吸混勻。接下來，再將配置好的Vigofect轉染試劑的混合溶液分別與混有重組質粒或空載體的混合溶液輕輕混勻，室溫靜置20 min。最后將鋪好的兩皿乳腺癌ZR75-1細胞，一皿作為對照樣本，轉染pEGFP-C1空載體；另一皿作為實驗樣本，轉染pEGFP-Sp1重組質粒。將細胞置于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養8 h，之后更換新鮮完全培養基，24 h后收取細胞。將細胞先用1 mL PBS清洗一遍后，再加入1 mL胰酶消化細胞，待2 min消化結束后，用PBS重懸，3 000 r/min離心5 min后盡可能棄去上清液，加入約細胞體積2倍的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，再加入與RIPA等體積的2 × SDS，沸水煮15 min，12 000 r/min離心2 min，取上清后行SDS-PAGE電泳，將SDS-PAGE中的蛋白經半干電轉儀轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，孵育抗體GFP或β-actin時長為2 h，稀釋比例為1∶500。回收一抗后，TBST洗膜3次，5 min/次，再 孵 育 二 抗，TBST洗 膜3次，5 min/次，化學發光顯色法顯影。

4Sp1在人乳腺癌ZR75-1細胞的定位 按照上述轉染要求，將pEGFP-C1空載體或pEGFP-Sp1重組質粒轉染入6 cm皿人乳腺癌ZR75-1細胞中，轉染8 h后換液，換液后繼續培養24 h。將乙醇殺菌過的潔凈無菌蓋玻片預先放置入新的6孔板中，將目的細胞胰酶消化后降低細胞密度，并把細胞均勻鋪于6孔板中，待細胞完全貼壁后，PBS 1 mL洗兩遍，孔板中加入4%多聚甲醛，液體量完全沒過細胞即可，常溫固定30 min。固定完成后，每孔再添加2 mL濃度0.5% Triton-100與1% NGS的PBS混合液，于冰上孵育10 min，有利于裂解細胞。用濃度為1% NGS的PBS混合液封閉，搖床搖10 min，封閉3遍。最后用PBS漂洗細胞3次，10 min/次。使用終濃度為1 μg/mL DAPI滴在玻片的位置上，避光孵育5 min，之后再用PBS清洗玻片3次，5 min/次，最后在熒光顯微鏡下觀察Sp1在ZR75-1細胞內的定位。

5RNA樣品提取及RT-PCR檢測下游細胞周期相關基因轉錄水平的變化 按照上述轉染要求，將pEGFP-C1空載體或pEGFP-Sp1重組質粒轉染入6 cm皿人乳腺癌ZR75-1細胞中，轉染8 h后更換新鮮完全培養基，24 h后收取細胞于1.5 mL EP管中。向EP管中加入1 mL Trizol Regent，盡可能將細胞充分懸浮，再加入200 μL氯仿，混勻后4℃下12 000 r/min離心15 min。將上層水相轉移至準備好的1.5 mL EP管中，等體積加入異丙醇，充分混勻后，在-80℃冰箱中靜置30 min。解凍后4℃下12 000 r/min離心10 min，離心結束后可在EP管的根部看到白色膜狀物，小心棄去上清后，依次用75%乙醇和無水乙醇進行清洗，最后自然晾干約20 min，以使得乙醇完全揮發。用DEPC水溶解RNA后利用Multiskan FC型酶標儀檢測提取出的RNA濃度。將RNA與M-MLV、5×buffer、10 mm dNTP和RNase Inhibitor按照比例充分混勻后置于42℃金屬浴，加熱1 h，接著加熱至95℃，加熱5 min，完成逆轉錄過程，得到最終產物cDNA。按照每個樣品設置3個復孔的要求，將稀釋過的cDNA樣品、引物上和下游混合液體、SYBR混勻后加入用于RT-PCR的八聯排小管中，使用GAPDH作為內參，上機結束后數據按2-△△Ct公式計算出基因表達的相對量。引物序列見表1。

表1 合成RT-PCR寡核苷酸序列Tab. 1 Synthesis of oligonucleotide sequences for RT-PCR

6統 計 學 分 析 利 用GraphPad Prism 9軟 件 及SPSS26.0軟件進行數據分析處理，實驗數據的計算比較采用兩獨立樣本的t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1pEGFP-Sp1重組質粒構建與鑒定 以本實驗室乳腺文庫為模版，PCR擴增Sp1基因片段，跑膠結果顯示片段大小約為2 358 bp，與目的基因片段大小一致(圖1)。將雙酶切和酶連后的質粒轉化入大腸埃希菌，過夜后挑起單克隆菌落，進行菌液PCR(圖2)，選擇其中的陽性克隆利用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切進行鑒定，以pEGFP-C1空載體為對照，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，克隆所得質粒雙酶切后可見兩條特異性條帶，大小約5 000 bp和2 358 bp(圖3)，與載體和目的基因大小相同。質粒送測序，鑒定正確，表明該基因重組質粒構建成功。

圖1 Sp1基因PCR產物電泳圖(M：BM5000 DNA標志物；1：PCR擴增產物)Fig.1 PCR amplification products of the target gene Sp1 (M:BM5000 DNA marker; 1: PCR amplification products)

圖2 pEGFP-Sp1菌液PCR鑒定結果[M：BM5000 DNA標志物；1：陽性對照(以人乳腺文庫為模板)；2和3：挑取的單克隆菌落；4：陰性對照(以雙蒸水為模板)]Fig.2 PCR identification of pEGFP-Sp1 (M: BM5000 DNA marker;1: positive control [human breast library as template]; 2 and 3: Monocolonal colonies were picked up; 4: negative control[double distilled water as template])

圖3 pEGFP-Sp1雙酶切產物鑒定(M：BM5000 DNA標志物；1：pEGFP-C1空載體；2：pEGFP-Sp1重組質粒)Fig.3 Identification of pEGFP-Sp1 double enzyme digestion product (M: BM5000 DNA marker; 1: pEGFP-C1 empty vector; 2: recombinant plasmid of pEGFP-Sp1)

2Weston blot鑒定pEGFP-Sp1蛋白表達 人乳腺癌ZR75-1細胞分別轉染pEGFP-C1空載體或pEGFP-Sp1重組質粒，8 h換液，轉染24 h后，收集細胞裂解后，進行Western blot檢測Sp1蛋白表達情況。結果顯示，轉染pEGFP-C1質粒的樣品在相對分子質量約28 × 103處出現特異性條帶；轉染pEGFP-Sp1質粒的細胞樣品約在120 × 103處可見特異性條帶(圖4)。

圖4 Western blot檢測pEGFP-Sp1蛋白表達Fig.4 Expression of pEGFP-Sp1 detected by western blot

3Sp1定位于乳腺癌細胞ZR75-1的細胞核 據文獻報道，Sp1作為轉錄因子通常入核發揮功能。本實驗通過觀察外源轉入pEGFP-C1或pEGFP-Sp1重組質粒的ZR75-1細胞，發現外源轉入pEGFPC1后綠色熒光在細胞核與細胞質中均勻性分布，而外源轉入pEGFP-Sp1后綠色熒光集中于細胞核中，說明Sp1主要定位在ZR75-1細胞核中(圖5)。

圖5 熒光顯微鏡觀察pEGFP-Sp1在ZR75-1細胞中的定位(400×)Fig.5 The observation of the localization of pEGFP-Sp1 in ZR75-1 cells by fluorescence microscopy (400×)

4體外過表達Sp1影響其下游調控基因的轉錄水平 據文獻報道，在未轉化細胞中過表達Sp1會導致細胞G1/S期轉換調節基因的表達發生改變，誘導細胞周期阻滯。通過RT-PCR結果發現，過表達pEGFP-Sp1重組質粒的ZR75-1細胞，細胞內Cyclin D2和CDK6的mRNA水平顯著下調，Cyclin G2和p18 mRNA水平顯著上調，而CDK2、p16、p21、Cyclin E1轉錄水平無顯著改變，說明Sp1在一定程度上參與細胞周期基因的轉錄調控(圖6)。。

圖6 RT-PCR檢測過表達Sp1對其下游細胞周期相關基因轉錄水平的影響(aP<0.05，bP<0.01，vs pEGFP-C1)Fig.6 RT-PCR was used to detect transcriptional effects of the downstream genes about cell cycle through overexpressing Sp1 (aP<0.05, bP<0.01, vs pEGFP-C1)

討 論

盡管近些年針對乳腺癌的基礎研究和治療手段取得了巨大進展，但乳腺癌仍是當今中國女性最常見的癌癥，患者的生存率仍不容樂觀，因此確定有效的生物標志物并闡明其在乳腺癌發生發展中發揮的調控作用十分迫切[13-14]。

Sp1作為腫瘤疾病中關鍵性轉錄因子，在腫瘤增殖、分化和凋亡途徑中發揮著重要作用，它既可以多聚體形式結合某些基因啟動子上的單個結合位點，也能夠動態招募許多因子形成復合物以協同激活包含多個結合位點的啟動子[4]，進而實現對基因精細復雜的調控，因此機體對Sp1的表達水平及活性有著嚴格的控制，總體來說高水平的Sp1蛋白在絕大多數腫瘤中是一種不利的預后因素，Sp1表達在許多腫瘤細胞中增加，這可能是腫瘤生長及維持的關鍵因素。與正常乳腺細胞相比，Sp1在N-甲基-N-亞硝基脲誘導的乳腺腫瘤細胞中顯示過度積累[15]。在纖維肉瘤轉化模型中，Sp1水平在轉化過程中也會增加，而降低這些人轉化成纖維細胞中Sp1的表達會抑制它們的致瘤性[16]。然而Sp1的表達水平并不與腫瘤惡性程度一直呈正相關性，隨著細胞的衰老，細胞內的Sp1水平會呈現出逐漸下降的趨勢[17]，這也在一定程度上表明Sp1在乳腺癌發展過程中發揮著不同作用[15]。

有研究證實，在未發生腫瘤轉化的細胞中過表達Sp1，全基因表達譜中鑒定出的差異基因主要在腫瘤、細胞死亡和細胞周期相關的基因中富集[18]。另有研究表明，在非小細胞肺癌中 Sp1可通過增加Syncytin1表達而促進腫瘤細胞增殖，降低Sp1可抑制Cyclin D1、CDK6和CDK4的表達，使細胞阻斷在G1期[19]。在結腸癌中Sp1過表達可顯著提高miR-146b-3p 表達進而促進增殖、遷移和侵襲，并促進細胞G1期到S期的轉換[20]。在肝癌中Sp1誘導STK39高表達進而促進了肝癌細胞增殖、遷移和侵襲。此外，抑制Sp1功能或敲低STK39可誘導HCC細胞周期停滯在G2/M期并促進細胞凋亡[21]。由此可見Sp1在不同腫瘤中發揮著不同功能，并且在機體中作用非常復雜，但都與細胞周期存在著緊密的聯系。本實驗通過在乳腺癌細胞中過表達Sp1同樣發現Cyclin D、CDK6、Cyclin G2和p18這些關鍵細胞周期調控因子轉錄水平發生顯著改變，證實了文獻結果。另有文獻報道，Sp1是p16表達的關鍵調節因子，組蛋白乙酰轉移酶p300直接與Sp1的反式激活結構域相互作用，并被招募到p16啟動子，以實現p16表達調控[11]。同樣，早期研究表明通過孕酮受體的信號傳導，Sp1可介導依賴性的p21啟動子活性上調[12]。這些證據均提示Sp1與細胞周期通路密切相關。但本文并未發現p16、p21等因子轉錄水平有顯著改變，猜想可能細胞本體Sp1水平較高，導致外源性過表達Sp1效果不明顯，后續可以嘗試敲低Sp1表達，以深入探索Sp1參與調控細胞周期的分子機制。

本研究通過構建pEGFP-Sp1，發現在人乳腺癌ZR75-1中Sp1主要定位于細胞核，說明Sp1在人乳腺癌細胞中主要作為轉錄因子，結合細胞核內基因DNA片段發揮調控作用，并且過表達Sp1會改變細胞周期調控基因的轉錄水平，說明Sp1與細胞周期通路密切相關。但本研究結果尚未顯示過表達Sp1后細胞周期相關基因的蛋白表達水平變化以及是直接作用還是間接作用，因此Sp1調控人乳腺癌ZR75-1細胞周期相關基因的具體機制還有待進一步研究。