重復煙霧吸入建立肺損傷大鼠模型及肺纖維化評估

李虎明，縱加強，陳旭昕，丁毅偉，韓志海

解放軍總醫院第六醫學中心 呼吸與危重癥醫學科，北京 100853

火災時煙霧等吸入后可損傷呼吸道和肺實質，導致煙霧吸入性急性肺損傷(smoke inhalation induced acute lung injury，SI-ALI)，嚴 重 者 可 導致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，病理表現為炎性細胞聚集、肺泡間隔增厚和肺水腫等[1]。建立可靠且貼近臨床的SI-ALI動物模型是研究的基礎，研究人員根據目的進行不同方法造模，如不同動物或不同吸入方式的模型，然而沒有一種公認的模型可完全反映煙霧吸入損傷的特點[2]。而且煙霧吸入并發癥的研究較少，其損傷后期是否發生肺纖維化仍存在爭議。此外，火災時消防員煙霧吸入致傷的比例高達30%[3]，消防員等人群重復煙霧吸入風險高，而重復煙霧吸入致傷特點未見相關研究。因此本研究采用煙霧吸入致傷模型，觀察煙霧吸入損傷特點，比較重復煙霧吸入致傷與單次吸入致傷的特點，重點觀察煙霧吸入損傷后期肺纖維化情況，為煙霧吸入損傷的機制研究奠定基礎。

材料與方法

1實驗動物 2 ~ 3月齡清潔級成年雄性SD大鼠120只，體質量180 ~ 220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0006]。實驗前于清潔級動物房適應性飼養1周，室溫20℃ ~ 24℃，環境濕度50% ~ 70%，晝夜12 h節律，自由攝食和飲水。動物實驗操作遵守實驗動物條例，所有實驗過程經解放軍總醫院第六醫學中心(原海軍總醫院)動物倫理學會審核通過(倫理審查批號：HJZYY20170901)。

2煙霧造模材料及設備 本研究采用現代建筑裝修常見材料作為產煙物質，包括木屑、棉花、化纖材料、塑料、顆粒板材和電線，上述材料各10 g研磨成粉混合。應用自行研發的煙霧產生裝置，產煙物質置于電磁爐上方的托盤中，控制電磁爐溫度為300℃，待產煙箱中煙霧充盈后用排風機將煙霧通過管道排入試驗箱中，同時用煙氣檢測儀檢測箱內氣體濃度，通過控制排風機維持氣體濃度，CO 400 ~ 550 ppm，H2S 10 ~ 15 ppm，O218% ~ 20%。

3動 物 分 組 及 實 驗 120只SD大 鼠 隨 機 分 為4組，每組30只。A組為空白對照組，未經任何處理；B組煙霧吸入1次(1次/d × 1 d，15 min/次)；C組煙霧吸入3次(1次/d × 3 d，15 min/次)；D組煙霧吸入7次(1次/d × 7 d，15 min/次)；各組大鼠分別于完成煙霧吸入后第1天、第7天和第28天予以處理，進行炎性指標、血氣分析、濕干比和肺組織病理檢測。

4血氣與炎性指標檢測 大鼠于指定時間麻醉狀態下腹主動脈取血，于30 min內進行動脈血氣分析，并按ELISA試劑盒說明書操作，測定大鼠血漿中白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量。

5肺泡灌洗液檢測 腹主動脈取血后，大鼠胸正中線開胸分離暴露氣管、雙肺，分離結扎右主支氣管，氣管內緩慢注入0.9%氯化鈉注射液2 mL，回 抽 肺 泡 灌 洗 液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF) 1.5 ~ 1.8 mL。BALF于4℃下1 500 r/min離心10 min，取上清液采用ELISA方法檢測IL-6、TNF-α含量。

6肺組織濕干比測定 分離右肺各葉，取右肺上葉組織，0.9%氯化鈉注射液沖洗，用紗布吸干肺組織表面水分后稱質量，記為濕質量，放于錫箔紙置于60℃恒溫箱烘烤48 h至恒質量，再次稱質量，記為干質量，計算肺組織濕干比。

7肺組織病理學觀察 收集右肺下葉于4% 甲醛中，48 h后進行石蠟包埋，切片，脫蠟后行HE染色和Masson染色，光鏡下進行組織學觀察。

8統 計 學 處 理 使 用SPSS23.0軟 件 分 析 數 據，計量資料以±s表示，多組均數比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1造模動物情況 A組精神狀態佳，反應靈敏，被毛光潔，呼吸平穩，活動正常；B、C、D組大鼠煙熏過程中呼吸急促，焦躁不安，口鼻分泌物增多，并可見發紺，煙熏后被毛泛黃無光澤，活動明顯下降，2 ~ 3 d后逐漸恢復正常狀態。其中，C、D組大鼠呼吸急促、焦躁不安等癥狀加重，煙熏后精神萎靡，活動緩慢，易捕捉。

2煙霧吸入死亡率 A組大鼠無死亡；B組大鼠共死亡4只，總生存率86.7%；C組大鼠共死亡7只，總生存率76.7%；D組大鼠共死亡10只，總生存率66.7%。

3各組肺組織濕干比值比較 煙霧吸入后各吸入組肺組織濕干比在第1天最高，與A組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。隨著吸入次數增多，濕干比逐漸升高(P＜0.05)。第7天、第28天濕干比逐漸降低。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織濕干比值比較(aP＜0.05, vs A組; bP＜0.05,vs 第1天時本組; cP＜0.05, vs 同時間B組)Fig.1 The wet-dry ratio of rats’ lung tissue in different groups(aP＜0.05, vs group A; bP＜0.05, vs the 1st day in each group;cP＜0.05, vs group B at the same time)

4各 組 血 漿 及BALF炎 性 指 標 比 較 B、C、D組IL-6和TNF-α在煙霧吸入后第1天明顯升高，第7天、第28天逐漸下降，特別是BALF中IL-6在第28天時低于A組水平；隨著吸入次數增多，各炎性指標均有升高趨勢。見圖2。

圖2 各組大鼠血漿及BALF炎性指標變化(aP＜0.05, B、C、D組 vs A組)Fig.2 Changes of inflammatory factors in each group after smoke inhalation (aP＜0.05, group B, C, D vs group A)

5各組血氣分析指標比較 煙霧吸入第1天各吸入組大鼠動脈血氧分壓(PaO2)、pH下降，動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、乳酸(lactic acid，Lac)和碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin，COHb)升高，第7天、第28天時各指標逐漸恢復至正常水平；隨著吸入次數增多，PaCO2和Lac有升高趨勢，PaO2和pH有降低趨勢，但大部分血氣指標C、D兩組與B組相比差異無統計學意義。見圖3。

圖3 各組大鼠動脈血氣分析情況(aP＜0.05, B、C、D組 vs A組)Fig.3 Arterial blood gas analysis in each group after smoke inhalation (aP＜0.05, group B, C, D vs group A)

6各組大鼠肺組織HE染色 A組大鼠肺泡結構完整，腔內無滲出，肺泡間隔均勻一致，無腫脹。B、C、D組大鼠煙霧吸入第1天肺泡結構有彌漫性破壞，肺泡腔內可見紅細胞和白細胞浸潤，肺泡間隔增厚，炎細胞浸潤明顯。隨著吸入次數增多，肺泡間隔增厚和炎細胞浸潤更加明顯；第7天、第28天肺泡間隔較前好轉，炎性細胞浸潤減輕，肺泡腔內紅細胞、白細胞減少。見圖4。

圖4 各組大鼠煙霧吸入后不同時間點肺組織HE染色(100×)Fig.4 HE staining images of the lung tissues of rats exposed smoke inhalation at different time points (100×)

7各組大鼠肺組織Masson染色 A組大鼠肺組織肺泡結構清晰完整，無藍色膠原纖維沉積。B組第28天肺泡壁增厚，部分視野可見少量不均勻藍色膠原纖維沉積，部分大鼠無纖維化改變；C組、D組第28天出現較明顯藍色膠原纖維沉積，且范圍更為廣泛均勻，提示重復煙霧吸入后期可以導致明顯肺纖維化改變。見圖5。

圖5 煙霧吸入后第28天各組大鼠肺組織Masson染色(100×)Fig.5 Masson staining images of lung tissues of different groups on the 28th day after exposure to smoke inhalation (100×)

討 論

煙霧吸入引起的肺損傷是火災常見合并癥[4]。吸入性肺損傷發病率差異較大，一項包括54項研究408 157名燒傷患者的Meta分析顯示，吸入性損傷發生率1.2% ~ 74.6%，綜合發生率為15.7%(95%CI：13.4% ~ 18.3%)，并且伴有吸入性損傷的患者死亡率顯著升高(OR=3.2)[5]。另一項研究顯示無吸入損傷的燒傷病人死亡率2%，而伴有SI-ALI的燒傷患者死亡率20%，繼發肺部感染死亡率則高達60%[3]；SI-ALI患者死亡率顯著升高，而且缺乏針對性治療措施，動物實驗可行的救治措施臨床效果均不理想[6-7]，因此建立SI-ALI動物模型，探索其發病機制及救治方法具有重要意義。建立動物模型是研究基礎，現有多種煙霧吸入造模方法，為降低長時間煙霧暴露造成的動物死亡，縮短煙霧干預時間和間隔吸空氣是常用策略[2,8]。Zhu等[9]的研究中大鼠煙霧暴露方案為3次3 ~ 5 min的煙霧暴露，中間于空氣暴露30 s；另一項研究煙霧吸入間隔時暴露于100%純氧[10]。然而，沒有一種動物模型是公認的可以完全反映煙霧吸入致傷改變的理想模型。因為動物煙霧吸入時間受限，損傷動物并發癥出現較晚，煙霧吸入損傷遠期研究較少，而在有限的研究中，損傷后期是否發生肺纖維化仍存在較大爭議。此外，消防員、森林武警等特殊職業人群暴露于煙霧的風險高，存在重復煙霧吸入的風險，然而鮮有研究去了解重復煙霧吸入的致傷特點，重復煙霧吸入遠期是否更易導致并發癥亦未見報道。因此，本研究采用單次煙霧吸入、重復煙霧吸入建立多種煙霧吸入模型，觀察煙霧吸入致傷情況，重點觀察吸入后期肺纖維化情況，探索重復煙霧吸入致傷特點。

本研究結果顯示，單次煙霧吸入后濕干比、炎性指標升高，血氣指標改變，第1天最為嚴重，后隨著時間的延長各指標逐漸趨向于正常。HE染色示損傷后肺組織彌漫性破壞和炎性細胞浸潤，Masson染色顯示損傷后第28天肺纖維化改變較少，部分大鼠未見纖維化改變。本研究中煙霧吸入建模能反映煙霧吸入的致傷特點，與煙霧吸入性損傷患者病理一致[11-12]。與此同時，本研究通過重復煙霧吸入來評估其損傷特點，結果顯示重復煙霧吸入大鼠肺組織濕干比升高，血清及BALF炎性指標升高，肺組織損傷程度明顯加重，而血氣指標變化不大。需要特別關注的是，與單次煙霧吸入相比，重復吸入大鼠存在明顯且均勻的肺纖維化改變。

肺組織濕干比可反映肺水腫程度，本研究中煙霧吸入致傷后第1天肺水腫最嚴重，濕干比最高，后逐漸降低，重復吸入組濕干比明顯增高。炎癥反應是煙霧吸入導致肺損傷的重要機制，其中IL-6和TNF-α是重要的炎性因子[13]。既往研究顯示燒傷合并煙霧吸入患者IL-6含量增加[14]。本研究中IL-6和TNF-α在煙霧吸入后升高，重復煙霧吸入組升高更明顯，另外隨著時間延長，炎性指標逐漸下降。特別是第28天時，BALF中IL-6水平已低于對照組，其降低可能與損傷后期肺纖維化相關[15]。血氣分析是反映氣體交換的指標，其中氧合指數是診斷ARDS的必備條件[16]。本研究中煙霧吸入后PaO2、pH降低，PaCO2、Lac升高，后隨著時間的延長各指標逐漸恢復正常，而重復吸入組與單次吸入組血氣指標差異多無統計學意義，COHb在傷后第7天時已基本恢復正常，這與既往研究COHb 在損傷后2 h出現高峰，48 h大致恢復正常的結果一致[9]。

肺組織病理是判斷損傷程度的重要指標，既往研究顯示煙霧吸入后肺組織以炎性細胞聚集、肺泡間隔增厚和水腫出血為主要表現[1]。本研究中煙霧吸入后1 d時大鼠肺組織可見肺泡間隔增厚，并可見炎性細胞浸潤，后隨著時間的延長損傷程度減輕；重復煙霧吸入組與單次吸入組相比，肺泡間隔、炎性細胞浸潤加重。

煙霧吸入后是否發生肺纖維化仍存在較大爭議。有研究顯示煙霧吸入遠期預后較好，無明顯肺纖維化情況[1]。然而，Zhu等[9]的研究中吸入后第28天肺組織病理發生肺纖維化改變，可見肺泡壁增厚和纖維沉積，后續的研究也發現煙霧吸入后可發生肺纖維化改變[17]。本研究結果顯示單次煙霧吸入第28天肺纖維化改變不明顯；重復煙霧吸入組大鼠肺組織纖維化程度明顯加重，第28天時已出現廣泛均勻的纖維沉積。分析其原因，可能是反復的煙霧吸入導致更為廣泛且嚴重的肺組織破壞，后期修復異常，纖維組織沉積，從而導致肺纖維化改變[18]。

本研究發現重復煙霧吸入易導致肺纖維化改變，但本研究未進一步檢測肺功能指標，不能明確肺的通氣和換氣功能情況。且本研究為動物實驗，仍需通過臨床進一步驗證。在接下來的工作中，我們將開展臨床研究，并進一步完善肺功能相關檢查。

綜上所述，我們建立了穩定的煙霧吸入性肺損傷大鼠模型，并通過改變煙霧吸入條件，建立了單次和重復煙霧吸入動物模型，并探索其損傷特點。結果顯示，重復煙霧吸入可以導致更為明顯的炎性反應，其肺組織滲透性和肺組織損傷程度均明顯增加。尤其需要關注的是，單次煙霧吸入后第28天肺纖維化不明顯，而重復煙霧吸入后第28天出現明顯肺纖維化改變。