血漿游離DNA低深度測序技術對胎兒性染色體異常篩查價值的初步探討

李 莉，王曉菲，趙青冬，馬 瑩，付玉榮，于東渤，胡凌云，高志英，姜淑芳解放軍總醫院第一醫學中心，北京 00853 婦產科； 檢驗科

孕婦外周血內含有胎兒游離DNA及母體DNA片段，而大規模平行測序(massively parallel sequencing，MPS)技術的出現使無創產前基因檢測(noninvasive prenatal test，NIPT)用于檢測孕婦外周血游離DNA含量以評估胎兒罹患21號染色體、18號染色體、13號染色體非整倍體異常的風險。NIPT采用的是低深度測序技術，平均測序深度為0.1X，覆蓋全基因組[1]。因此在臨床應用中除了可檢測出目標疾病，還可檢測出性染色體或其他染色體異常，但臨床應用價值還有待論證。本研究回顧性收集我中心NIPT檢測的11 239例結果，初步評估NIPT檢測性染色體異常在臨床診療工作中的應用價值。

資料與方法

1資料 選取2018年6月 - 2021年7月于解放軍總醫院第一醫學中心婦產科經充分產前咨詢及孕婦知情同意，進行NIPT的孕婦11 239例。納入標準：符合《孕婦外周血游離胎兒DNA產前篩查與診斷技術規范》[2]適用標準的孕婦，如預產期年齡≥35歲，血清學篩查風險值介于高風險與切割值之間，介入性產前診斷禁忌證，錯過血清學篩查時間，通過體外受精或胚胎移植方式受孕以及自愿要求檢測的孕婦。排除標準：孕周＜12周，孕婦體質量指數＞40 kg/m2，雙胎以上者，夫妻雙方任一方有明確染色體異常，近期接受過異體輸血或免疫治療等外源性DNA介入，胎兒超聲檢查提示有結構異常，有基因遺傳病家族史，孕期合并惡性腫瘤。

2NIPT篩查方法 采集孕婦外周血5 mL置入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中保存，8 h內經二步分離法分離血漿并移入新的EP管內置-20℃保存。在本實驗室檢測時將保存的血漿解凍并充分混勻，采用華大生物科技有限公司的核酸檢測試劑、胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒、測序反應通用試劑盒對樣本經核酸提取、末端修復、標簽連接、PCR擴增、文庫混合、單鏈環化等步驟形成DNA納米球，并采用深圳華大基因生物醫學工程有限公司的BGISEQ-500基因測序儀進行低深度測序，平均測序深度0.1X。下機數據經Q20、胎兒游離DNA濃度、重復率等指標審核合格后發出NIPT報告。結果報告包括性染色體數目偏少(XO)、性染色體數目增多(XXX、XYY、XXY)、性染色體其他復雜異常。

3產前診斷驗證方法 依據不同孕婦的臨床指征選用以下2種或3種方法。1)羊水細胞培養及染色體核型分析：將約20 mL羊水離心棄上清處理后加入培養基混勻接種，經培養、換液、收獲、低滲、固定、老化、胰酶消化處理、吉姆薩染色后在顯微鏡下觀察細胞克隆及染色體形態，進行核型分析。結果判讀：計數10 ~ 15個克隆的染色體數目，分析3個染色體核型，并保存圖像。2)染色體熒光原位雜交檢測(fluorescence in situ hybridization，FISH)：取10 mL羊 水 離 心 去 上清，低滲及固定后再次離心棄上清，將沉淀物混勻，經滴片、烤片、探針雜交、細胞膜片洗滌、復染等流程處理后，熒光顯微鏡下閱片計數。結果判讀：隨機計數至少50個細胞，若90%以上細胞顯示正常信號類型則提示為正常樣本，60%以上細胞出現異常信號類型則提示為異常樣本。3)單核苷酸多態性微陣列檢測(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)：采用美國Affymetrix公司的CytoScan750K芯片及CytoScan750K配套試劑盒。將10 mL羊水樣本離心去上清后經消化、連接、PCR反應、純化、片段化、標記、雜交、芯片掃描，讀取掃描數據后在OMIM、DECIPHER、UCSC、DGV、PubMed等數據庫中查詢分析，結果報告為致病性變異、可能致病、臨床意義尚不明確、良性拷貝數變異。4)拷貝數變異測序(copy number variation sequencing，CNVseq)：采用聯合探針錨定聚合測序法檢測，平均測序深度達0.4X。首先使用核酸提取試劑盒提取羊水細胞DNA，經酶切打斷、修復反應、接頭連接、文庫制備、單鏈分離、環化及滾環復制生成DNA納米球，通過MGISEQ-2000測序儀進行測序。下機數據經過序列比對、去重、GC與窗口矯正等過程得到變異分析結果，結合ClinGen、ClinVar、DECIPHER、OMIM、UCSC、DGV等數據庫查詢分析，結果判讀為染色體非整倍體異常、致病性明確變異、疑似致病性變異、臨床意義未明變異、疑似良性變異或良性變異等。

4統計學分析 本組均為描述性統計，計數資料以百分比(%)表示。

結 果

1NIPT檢 測 結 果 11 239例 孕 婦 篩 查 時 年 齡17 ~ 46歲，檢測時孕周為12 ~ 31周，報告結果性染色體異常51例，陽性率0.45%(51/11 239)，其中性染色體數目偏少占45%(23/51)，性染色體數目增多占47%(24/51)，性染色體其他復雜異常及其合并5號染色體微缺失占8%(4/51)。見表1。

表1 NIPT篩查性染色體異常結果Tab. 1 Sex chromosomal abnormalities by NIPT

2產 前 診 斷 結 果 51例 性 染 色 體 異 常 病 例 中9例拒絕接受羊膜腔穿刺，42例接受者確診性染色體異常22例，陽性預測值(positive predictive value，PPV)為52%(22/42)；其中18例性染色體數目偏少(XO)確診8例，PPV為44%(8/18)；21例性染色體數目偏多(XXX、XXY、XYY)確診12例，PPV為57%(12/21)；3例性染色體其他復雜異常(合并5號染色體微缺失)確診2例，PPV為67%(2/3)，見表2、表3。42例經產前診斷的病例中有隨訪結局的39例，其中足月分娩且表型未見異常28例，早產但表型未見異常1例，終止妊娠10例，3例失訪。

表3 產前診斷染色體核型及分子遺傳檢測結果Tab. 3 Results of chromosome karyotype analysis and molecular genetic testing

討 論

人類胚胎性染色體非整倍體異常(sex chromosome aneuploidy，SCA)發生率高于21三體綜合征，其中45,X發生率最高，為1% ~ 1.5%[3]。而傳統的染色體非整倍體篩查不能篩查除有頸部水囊瘤的特納綜合征(turner syndrome，TS)以外的性染色體異常[4]。NIPT是對母體外周血中游離DNA進行高通量測序，將測序數據通過比對獲得每條染色體的有效序列數量，結合特定的遺傳學信息分析，評估胎兒罹患染色體非整倍體異常的風險。目前NIPT應用于臨床主要檢測的是21三體綜合征、18三體綜合征、13三體綜合征，同時也能檢測出性染色體異常(包括罕見異常)等[5]。本研究11 239例數據中篩查出性染色體異常51例，其中性染色體數目偏少(XO)23例(45%)，性染色體數目增多(XXX、XXY、XYY)24例(47%)，性染色體其他復雜異常4例(8%)，與文獻相符[6]。許多學者關注這項檢測在性染色體疾病篩查中的應用價值，各文獻報道SCA的PPV略有差異。路興軍等[7]文獻中SCA復合PPV為64.37%。Song等[8]文獻中SCA的PPV為54.55%，XO、XXX、XXY、XYY的PPV分別為23.53%、70%、75%、80%。Petersen等[9]文獻報道XO、XXX、XXY的PPV分別為26%、50%、86%。本研究總陽性預測值52%，與文獻相符，而XO、XXX、XXY、XYY的PPV分別為44%、60%、71%、25%(表2)，與相關文獻不完全一致，這可能與觀察數據量不同有關，若能在現有方法上增加測序深度，有望提高檢測的準確性。

表2 性染色體異常分類及陽性預測值Tab. 2 Types and PPV of sex chromosomal abnormalities

本研究性染色體數目偏少的8例中，典型的TS核型45,X0有2例；嵌合型5例，包括45,XO/47,XXX嵌合2例，45,XO/46,XX嵌合3例；X染色體結構異常1例。Turner綜合征核型復雜多樣，其中以XO較為常見，應用熒光原位雜交技術或基因芯片技術可準確識別疑難異常染色體[10]。8號標本染色體核型為46,X,?X，懷疑其中一條性染色體結構異常。進一步行SNP-array檢測，結果為X染色體Xq21.1q28區段存在77.6 MB片段缺失及2號染色體2p25.3p13.2區段存在71.7 MB的重復，分別內含COL4A5(303630)、MTCP1(300116)等357個及MYT1L、SOX11等303個OMIM基因。已有報道稱累及COL4A5、FACL4、AMMECR1等基因的Xq22.3區段的缺失與X染色體連鎖Alport綜合征伴智力障礙、面中部發育不良、橢圓形紅細胞增多癥等疾病相關[11-12]。累及MYT1L基因雜合突變與常染色體顯性遺傳智力障礙39型疾病有關。2號染色體短臂部分三體性重復與智力障礙、面部異常、心臟異常、發育遲緩等臨床表型有關[13-14]。此病例排畸超聲檢查顯示胎兒一側鼻骨未顯示，引產后流產兒表觀鼻骨缺失。

性染色體數目偏多的12例中，染色體核型為47,XXX和45,X/47,XXX嵌合5例，微缺失微重復1例，47,XXY 4例，48,XXYY 1例，47,XYY 1例。13號標本的篩查結果為XXX，其產前診斷核型結果為45,X[39]/47,XXX[11]，FISH結果為XO(69%)/XXX(31%)。產前診斷結果與NIPT篩查結果不完全一致，可能是樣本來源不同所導致。NIPT檢測的母體外周血胎兒游離DNA來源于胎盤母體面的滋養層細胞，而產前診斷的樣本為羊水，羊水細胞主要來源于胎盤的胎兒面脫落細胞以及胎兒體表、泌尿道、呼吸道、消化道等脫落的細胞[15]。篩查結果為XXX的14號樣本，產前診斷染色體核型分析結果未見異常。進一步行SNP-array檢測發現，Xp22.2區段存在1.2 MB片段重復，2號染色體2q13區段存在482.1 kb片段缺失。分別內含HCCS(300056)、AMELX(300391)等5個及NPHP1(607100)等3個OMIM基因。查詢數據庫綜合分析，Xp22.2片段重復報告為臨床意義尚不明確。而2號染色體2q13片段缺失內含的NPHP1(607100)OMIM基因的純合型或復合雜合型突變/缺失與常染色體隱性遺傳的Joubert綜合征4型、青少年腎消耗病等疾病有關[16]。Joubert綜合征4型臨床表型有獨特小腦腦干畸形、肌張力減退、發育遲緩等。青少年腎消耗病臨床表型有多尿、慢性腎病、發育遲緩等，NPHP1基因致病性變異占其總發病原因的20% ~ 25%。Decipher數據庫(Patient：305068)中有小于該片段的缺失引起視力異常，全面發育遲緩等臨床相關表型報道。綜合分析后認為胎兒是NPHP1基因缺失的攜帶者。本例胎兒出生后隨訪表型未見異常。19號標本的篩查結果為XXY，其產前診斷核型為48,XXYY，FISH結果為XXYY，屬于罕見的性染色體異常核型，可導致性分化異常綜合征[17]。可能為親代生殖細胞在減數分裂時性染色體不分離所導致[18]。這種篩查與診斷結果不一致也可能是因為X染色體含1 098個基因，Y染色體含有78個基因，其中有58個為同源基因并且大多數(29/58)位于性染色體末端，而外周血游離DNA片段長度和二代測序儀讀長皆較短等原因易使部分測序序列在X染色體和Y染色體之間的比對或排序定位發生錯誤所導致。此外，48,XXYY等罕見型綜合征發生概率較低，也易引起NIPT生信分析算法的偏差而產生結果誤判[18-19]。充分咨詢后，孕婦選擇終止妊娠。

NIPT下機數據分析出現的性染色體異常超出XO、XXX、XXY、XYY等可分析型別時，會報告性染色體其他復雜異常。本研究篩查出性染色體其他復雜異常4例，其中3例接受產前診斷，2例確診。性染色體其他復雜異常合并del(5p15.33-p12,45.40M)的21號樣本，其產前診斷顯示染色體核型未見異常。進一步行CNV-seq檢測，結果為46,XN,dup(22q11.21)(18,702,826-21,746,118)×3。查詢相關數據庫綜合分析，報告為已知致病變異。該 區 域 有“Chromosome 22q11.2 microduplication syndrome”的相關報道[20]。主要臨床表型為先天心臟畸形、面部畸形等，但該病臨床表型多樣，由正常到嚴重不一。經充分咨詢后，孕婦選擇繼續妊娠。胎兒出生后隨訪，表型未見異常。22號樣本篩查結果為性染色體其他復雜異常，產前診斷染色體核型為46,XN,1qh + ，FISH結果未見異常。大多數染色體的著絲粒區和次縊痕處分布有異染色質，常是染色體多態性涉及區域。1qh +表示1號染色體長臂異染色質區長度增加，多為多態[3]。充分咨詢后，孕婦選擇繼續妊娠，胎兒出生后隨訪，表型未見異常。

NIPT篩查報告性染色體異常的42例接受羊膜腔穿刺，22例明確產前診斷結果，PPV為52%，假陽性結果的主要原因為胎盤嵌合、母體嵌合、雙胎中一胎為45,X且胎兒死亡后被吸收清除、母親惡性腫瘤等[3]。本研究對假陽性病例分析發現1例 NIPT結果為“性染色體偏少-M”的病例。“-M”代表來源母體原因可能性大，數據分析時這部分數據無法分析，導致無法判讀其胎兒染色體是否正常，故按照異常結果報告，此病例產前診斷結果未見異常。進一步采集母親外周血進行培養及染色體核型分析，其結果為45,X[16]/46,XX[84]，故本例假陽性為母體性染色體嵌合所致。經臨床咨詢后孕婦選擇繼續妊娠，胎兒出生后隨訪，表型未見異常。

綜上所述，NIPT應用于產前篩查性染色體異常，雖然PPV低于其它臨床目標疾病，但其對于發現典型的SCA及罕見異常核型、致病性微缺失微重復等有一定的臨床意義。因此對于NIPT篩查結果為性染色體異常的孕婦，建議行產前診斷及超聲檢查進一步確診，并及早進行臨床咨詢和干預。