腹瀉犢牛大腸埃希菌分離鑒定與藥敏試驗

馬海蓮

（青海省海東市樂都區共和鄉畜牧獸醫站，青海 海東 810700）

0 引言

犢牛大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌感染引發的一種常見的細菌性疾病，臨床上以新生犢牛的易感性最強，主要發生在冬春季節，具有極高的發病率和死亡率[1]。新生犢牛大腸桿菌病發病速度較快，短時間內能夠造成犢牛死亡，根據其臨床癥狀的不同，將其劃分成腸炎型，腸毒素型以及辦學癥型，如果沒有及時對病情做出有效的診斷并開展針對性的治療，在短時間內犢牛就會死亡。很多患病牛在出生10～14日齡之后就會受到大腸桿菌的侵染，發病后體溫升高到41 ℃，最高升高到42 ℃，并且在發病24 h內會排出膠凍狀的黃色糞便，糞便中會夾雜很多血絲和黏液。如果犢牛沒有死亡，隨著病情的進一步延長，很可能會出現腕關節副關節腫大，炎癥病變，有時還會表現為肺炎，支氣管炎等呼吸道癥狀。針對犢牛大腸桿菌病應該做到早發現、早診斷、早治療，否則后患無窮。

1 材料與方法

1.1 材料獲取

本次研究大腸桿菌病分離鑒定的病源來源于一個牦牛養殖場的患病犢牛。犢牛在發病2～3 d后死亡，并且該類疾病在養殖場中傳播速度較快，短時間內引起了大批量的犢牛發病。解剖犢牛，采集病死牛的肝臟和脾臟組織。大腸桿菌致病性試驗過程中，主要選擇使用10只小白鼠，按照原隨機原則，將其劃分成2個組別，1組為試驗組，1組為對照組，每組5只小白鼠。病原分離鑒定過程中主要涉及到普通肉湯培養基、瓊脂平板、血液瓊脂平板、麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍培養基、三糖鐵斜面。同時按照大腸桿菌病生化鑒定的相關要求，配置了糖發酵管、MR試劑、VP試劑、明膠溶液、檸檬酸鹽試劑、吲哚試驗試劑。藥敏試驗期間共選擇左氧氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、頭孢拉定、呋喃托因、環丙沙星、頭孢先鋒、恩諾沙星等抗生素，按照紙片擴散檢測法來判定抗生素的敏感，在試驗過程中配置了高速的冷凍離心機、滅菌儀器，凝膠成像分析系統，電子天平。

1.2 試驗方法

在檢測過程中，首先采集了患病牛的新鮮血液，分別進行了牛病毒性腹瀉、牛腺病毒、冠狀病毒、輪狀病毒的抗體水平監測，由于沒有免疫接種上述幾種疫苗，血清中的抗體水平相對較低，沒有達到相應的要求，因此排除了上述幾種病毒感染的可能。隨后進行了細菌分離鑒定，生化鑒定及藥敏試驗。將采集到的病料充分研磨后，劃線接種到鮮血瓊脂平板上，尖形成菌落之后轉移到血液瓊脂平板提純，然后分別接種到普通肉湯、普通平板、鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板上，持續培養一段時間后，觀察致病菌菌落的形態。將分離得到的致病菌再進行生化鑒定。將分離到的致病菌制作成懸濁液后，注射到小白鼠體內，與對照組一同養殖，觀察小白鼠注射后的臨床癥狀，然后對病死小白鼠進行解剖，檢查肝臟、心臟、脾臟的病變，用紙片擴散法開展藥敏試驗。

2 結果

2.1 病原分離鑒定結果

從采集到的病變臟器組織中分離到一種菌株，將其染色后為格蘭氏陰性染色的中等大小的菌落，兩端鈍圓，兩端染色較為明顯，成對排列或者單個存在。提純后的致病菌能夠使肉湯均勻渾濁，并且在普通瓊脂培養基上良好的生長，菌落形態呈現濕潤、光滑、凸起、半透明、邊緣整齊，直徑大小在2～4 mm。在血液瓊脂平板上不存在溶血現象，能夠在麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板上生長出粉紅色和紫黑色的菌落并帶有金屬光澤。生化鑒定結果符合大腸桿菌的特征。

2.2 致病性檢測

注射了懸濁液的小白鼠在6 h后出現了典型的臨床癥狀，表現為精神萎靡不振，不能正常采食，全身肌肉震，蜷縮在角落中不愿走動，被毛雜亂，24 h后就會死亡，對照組小白鼠正常，沒有出現死亡，對病死小白鼠解剖發現，肺臟出血，肝臟腫大。將病變臟器組織粉碎之后，制作成涂片，為革蘭氏陰性染色的中等大小的桿菌，與上述分離得到的桿菌形態一致。

2.3 藥敏試驗

左氧氟沙星、慶大霉素、卡那霉素呈現高敏抑菌圈直徑，分別在25、24和34 mm，其他幾種抗生素呈現中敏或者低敏，如表1所示。

表1 藥敏試驗結果

3 結束語

大腸桿菌侵入腸道后會使腸黏膜出現嚴重的損傷，并且某些特別血清型的大腸桿菌繁殖還會產生很多腸毒素，這些腸毒素對幼齡階段的犢牛具有較強的致病性。腸毒素中的某些蛋白質可以黏附在小腸的上皮細胞[2]，并在小腸中定居，避免被排出體外。并且這些腸毒素還會進一步抑制腸道對電解質尤其是鈉的正常吸收，使大量的鈉離子和水滯留在腸道中，進而引發機體嚴重的脫水和腹瀉[3]。在疾病診治過程中，通過對患病牛的臨床癥狀進行判定，推測是產毒素的大腸桿菌引發的大腸桿菌病。通過動物致病性檢測能夠發現本次分離到達大腸桿菌菌株具有較強的致病性和毒力，是引起該養殖場犢牛發病的主要原因。

大腸桿菌耐藥性檢測能夠發現該類致病原被很多抗生素已經產生了比較嚴重的耐藥性，僅僅有3種抗生素為高敏抗生素。在篩選出敏感抗生素之后，從中篩選出1～2種的抗生素，對患病牛進行肌肉注射治療，交替使用抗生素，連續用藥5 d后犢牛的臨床癥狀逐漸恢復，病情得到了有效控制，并沒有繼續出現發病情況。