B7-H3與肺腺癌EGFR-TKI靶向治療繼發性耐藥的相關性研究

楊 英，丁 萌，唐 偉，劉歡歡，樊星語，陳禮文

肺癌是目前世界上癌癥相關性死亡的主要原因之一，其發病率在男性腫瘤中位居第一，在女性腫瘤中位居第二[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌的80%～85%，其中最常見的組織學亞型為腺癌[2]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為原癌基因c-erbB1的表達產物，是NSCLC的常見驅動因素和治療靶點之一。對于EGFR突變的晚期肺癌患者，中國臨床腫瘤協會(CSCO)推薦使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)作為一線治療藥物[3]。EGFR最常見的敏感型突變為外顯子19位點缺失(DEL E746-A750)和外顯子21位點突變(L858R)，分別占比所有EGFR突變約50%和40%[4]。與放化療等傳統治療比較，EGFR-TKI臨床獲益的患者表現為無疾病進展期(progression-free survival,PFS)延長，客觀反應率(objective response rate,ORR)提高，生活質量得到極大改善。但肺癌患者在接受EGFR-TKI靶向治療后不可避免的產生了獲得性耐藥性，這給肺癌的治療帶來了另一個挑戰。

B7-H3(CD276)是B7家族的一員，屬于B7-CD28通路的免疫檢查點分子。B7-H3已被報道在多種惡性腫瘤中高表達，在肺腺癌中的陽性表達率約為60%，與患者的臨床預后成負相關[5]。課題組前期研究結果顯示B7-H3對EGFR-TKI靶向治療具有調控作用，B7-H3基因敲除H3255和HCC827細胞對吉非替尼敏感性顯著增加[6]，但其對EGFR-TKI靶向治療繼發性耐藥的作用目前尚未見報道。鑒此，該研究將圍繞B7-H3對EGFR-TKI靶向治療繼發性耐藥作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2016年9月—2021年5月在安徽醫科大學第二附屬醫院接受外科切除或穿刺活檢且有完整資料記錄的肺腺癌患者。患者納入標準：① EGFR敏感突變并接受EGFR-TKI標準化治療，直至疾病進展或出現無法忍受的不良反應；② 數據分析時，治療時間至少為3個月。排除標準：① 臨床資料統計不全；② 嚴重心肺疾病。本研究經安徽醫科大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準，受試者簽署書面知情同意書。

1.2 實驗材料兔抗人單克隆抗體CD276、β-actin購于英國Abcam公司；羊抗兔二抗、DAB顯色劑、檸檬酸鹽修復液均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；肺腺癌細胞系HCC827和H3255 購于上海富衡細胞庫；RPMI 1640培養基購自美國 Gibco 公司； 胎牛血清購于美國Lonsera公司；吉非替尼購自美國MCE公司；蛋白裂解液 RIPA購于上海碧云天生物技術有限公司；蛋白酶抑制劑PMSF購于美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組織化法檢測B7-H3的表達 收集肺腺癌患者的石蠟切片，脫水、脫蠟后將檸檬酸修復液倒入高壓鍋進行加熱修復抗原，3%過氧化氫阻斷10 min，PBS沖洗后加入適當稀釋(1 ∶100)的一抗(50 μl)，37 ℃孵育60 min；滴加已標記的酶標抗鼠/兔聚合物，室溫孵育15 min左右后PBS沖洗。新鮮配置酶底物顯色液DAB，顯微鏡下控制顯色，室溫下染色3～5 min。脫水、透明、封片、顯微鏡觀察拍照。癌細胞B7-H3表達強度定義為0(無)、1(弱)、2(中)、3(強)。本實驗評估了B7-H3在腫瘤細胞膜和胞漿中的表達，對每一種B7-H3強度下的腫瘤細胞百分比進行評分。根據染色強度和陽性細胞百分比將標本分為低B7-H3表達組(1和2均<50%且3<25%)和高B7-H3表達組(1或2≥50%或3≥25%)進行統計分析。

1.3.2人EGFR敏感型突變肺腺癌細胞HCC827和H3255的培養及構建吉非替尼耐藥細胞株HCC827/GR和H3255/GR 人肺腺癌細胞HCC827和HCC827/GR、H3255、H3255/GR放入含胎牛血清(10%)、青霉素(100 KU/L)及鏈霉素(100 mg/ml)的RPMI 1640培養基，在37 ℃，5% CO2培養箱(HF90/HF240,Heal Force)中常規培養傳代。在人肺腺癌吉非替尼敏感細胞株HCC827的培養基中，按0.001、0.002、0.005、0.01、0.012 5、0.015、0.017 5、0.02 μmol/L濃度梯度逐步增加吉非替尼濃度，用濃度為0.02 μmol/L的吉非替尼維持細胞耐藥性，以構建吉非替尼耐藥株HCC827/GR；在人肺腺癌吉非替尼敏感細胞株H3255的培養基中，按0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.075、0.1 μmol/L濃度梯度逐步增加吉非替尼濃度，用濃度為0.1 μmol/L的吉非替尼維持細胞耐藥性，以構建吉非替尼耐藥株H3255/GR。

1.3.3流式細胞術分析 將生長狀態良好的H3255、H3255/GR、HCC827、HCC827/GR細胞用胰蛋白酶消化；收集1×106個細胞，PBS清洗2次，最后用100 μl重懸；取5 μl Anti-B7-H3-PE單克隆抗體處理細胞，在4 ℃冰箱里孵育30 min進行染色，避光；PBS清洗2次后上機，采用XL-MCL流式細胞術分析計數1×104個細胞，用FIOWJO軟件進行數據分析和圖形輸出。

1.3.4Western blot實驗 用PBS沖洗后各孔加含1%PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上搖晃裂解30 min后刮取細胞至EP管，離心(14 000 r/min，30 min，4 ℃)后收集上清液并使用BCA法進行蛋白定量，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min后冰上冷卻。使用SDS-PAGE(10%分離膠+5%濃縮膠)電泳分離蛋白質，然后用電轉膜儀轉膜至PVDF膜，放入TBST洗去膜上的轉膜液后，封閉2 h。TBST洗膜3次后加入一抗(抗CD276，1 ∶100)中4 ℃震蕩孵育過夜。室溫孵育二抗1～2 h，ECL兩種試劑1 ∶1混勻后均勻滴加在膜上，使用ECL儀曝光顯色，以β-actin作為內參。

1.3.5評價肺癌對EGFR-TKIs獲得性耐藥標準 患者接受單藥EGFR-TKI治療(吉非替尼或埃克替尼)；同時具有以下情況則視為獲得性耐藥：EGFR-TKI治療后評估到的客觀臨床獲益；在過去30 d內持續接受吉非替尼或埃克替尼治療后出現全身疾病進展[實體腫瘤反應評價標準(RECIST)或WHO定義的疾病進展]；停止吉非替尼或埃克替尼與開始新療法之間沒有介入全身治療[7]。

2 結果

2.1 人口特征基線分析本研究共納入56例肺腺癌患者，年齡32～82(62.32±11.53)歲。除2例曾經吸煙者外，其余患者(n=54)均無吸煙史(戒煙時間超過1年)。患者B7-H3表達與年齡(<65歲vs≥65歲)、性別、腫瘤大小(≤25 mmvs>25 mm)、腫瘤分期(ⅢvsⅣ)、EGFR突變模式(19 Delvs21 L858R)以及EGFR-TKI靶向藥物選擇(吉非替尼vs埃克替尼)之間差異無統計學意義(P>0.05)。具體見表1。

2.2 肺腺癌患者B7-H3表達分析癌組織細胞膜和細胞漿B7-H3表達強度定義為0(無)、1(弱)、2(中)和3(強)(圖1 A～D)。根據染色強度和陽性細胞百分比將標本分為低B7-H3表達組和高B7-H3表達組，結果顯示高表達患者25例(44.6%)，低表達患者31例(55.4%)。

圖1 肺腺癌細胞B7-H3表達的免疫組化分析 HE ×200

2.3 腫瘤B7-H3表達水平與EGFR-TKI靶向治療耐藥分析截止本研究觀察終止時間，B7-H3低表達和高表達患者繼發性耐藥分別為12例(38.7%)和14例(56.0%)，其中位耐藥時間分別為13.2個月和5.1個月，差異有統計學意義(t=3.193，P=0.004)，表明高B7-H3組患者繼發性耐藥發生比例有所增加且耐藥發生時間顯著縮短(圖2)。

圖2 不同B7-H3表達水平肺腺癌患者EGFR-TKI耐藥比例和耐藥時間

2.4 吉非替尼耐藥細胞B7-H3表達分析流式細胞術和Western blot分析結果顯示，EGFR突變細胞株H3255和HCC827本身B7-H3表達水平較高，但誘導建立的吉非替尼耐藥株H3255/GR和HCC827/GR，與非耐藥株比較，其B7-H3表達水平進一步上調(P>0.05，因為B7-H3在肺癌耐藥與非耐藥細胞株本身表達都很高，導致統計分析顯示差異無統計學意義，但與非耐藥株比較，其B7-H3表達水平仍然進一步上調，圖3A、B)，進一步提示了B7-H3與EGFR-TKI獲得性耐藥的相關性。根據蛋白條帶做灰度值分析結果顯示兩種耐藥株B7-H3的表達較非耐藥株均上調，但灰度值之間差異無統計學意義(F=0.505、0.426,P=0.517、0.550，圖3C)。

圖3 流式細胞術和Western blot及蛋白條帶灰度值分析吉非替尼耐藥H3255和HCC827細胞株B7-H3表達

3 討論

在56例病例中研究了具有EGFR敏感型突變且接受EGFR-TKI靶向治療的肺腺癌患者B7-H3的表達和人口學特征對其表達的影響。免疫組化結果顯示B7-H3表達水平在肺腺癌患者中存在明顯差異，結果與Inamura et al[8]基本一致，Inamura et al研究表明EGFR野生型患者B7-H3表達水平高于EGFR突變型，并且吸煙患者高于不吸煙患者。此外本研究還發現B7-H3表達水平與患者年齡、性別、腫瘤大小與分期、EGFR突變亞型等差異均無統計學意義，結果與Sun et al[9]研究結果一致。

本研究發現高B7-H3表達與患者更易出現耐藥性成正相關，盡管接受EGFR-TKI靶向治療的肺腺癌患者大部分最終都會不可避免的發展為獲得性耐藥，50%～60%都與T790M管家基因出現突變有關，T790M突變使EGFR對ATP的親和力增加，從而導致與ATP競爭的TKIs的置換[10]。本研究中B7-H3高表達組與低表達組存在明顯差異，高表達組患者更易出現臨床耐藥性，發展為耐藥的時間較低表達組明顯縮短，提示B7-H3可能為EGFR-TKI耐藥的另一機制。B7-H3誘導的信號轉導可促進EGFR突變的肺腺癌細胞的存活，并降低其對吉非替尼的敏感性，并且有研究表明肺腺癌患者在接受EGFR-TKI靶向治療前后其腫瘤微環境發生了改變[11]。本研究推測抑制B7-H3可能對肺癌腫瘤微環境也會產生有利影響，促進肺癌患者對靶向藥物的敏感性，從而降低患者臨床耐藥率。

本研究成功誘導培養吉非替尼耐藥的EGFR突變肺腺癌細胞株H3255和HCC827，并進行Western blot分析，EGFR突變細胞株H3255和HCC827本身B7-H3表達水平較高，與野生型細胞株比較，耐藥株B7-H3表達水平進一步增加。B7-H3在肺腺癌等多種惡性腫瘤中與腫瘤轉移復發和臨床預后不良密切相關，B7-H3除了在免疫調節方面可以抑制腫瘤微環境中抗原特異性CD8+T細胞和NK細胞活性而促進腫瘤免疫逃逸，本身又可通過非免疫性機制促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移[12]。另外，B7-H3誘導的信號通路包括3個級聯通路：PI3K/AKT、JAK2/STAT3和Raf/MEK/ERK1/2，其促進腫瘤侵襲、遷移、血管生成和降低對藥物的敏感性[13]，它們也參與肺腺癌細胞EGFR觸發的信號通路，表明B7-H3誘導的信號通路與EGFR信號通路部分具有共同的下游信號級聯，這促使本研究推測B7-H3是否能成為EGFR-TKI耐藥潛在的治療靶點。并且課題組前期研究證明了B7-H3基因敲除H3255和HCC827細胞對吉非替尼敏感性顯著增加[6]，這進一步證實了B7-H3抑制可能是治療EGFR-TKI耐藥的一個有前途的選擇。

綜上所述，本研究證明共信號分子B7-H3在肺腺癌的表達水平存在明顯差異，并且B7-H3高表達與肺腺癌患者EGFR-TKI靶向治療的獲得性耐藥存在相關性，提示抗B7-H3治療可能是預防EGFR-TKI耐藥一個有前途的治療策略，但關于B7-H3是如何影響耐藥性及其相關作用機制有待后續實驗進一步研究證明。