p100Rb和p80Rb過表達對細胞周期和凋亡的影響

李 強，李彩紅，周 恒，喬 兵，劉建軍，范禮斌

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)是一種早發的兒童惡性腫瘤，是由基因突變導致的[1]，基因分析表明RB的發生與RB1基因的突變有關[2]。RB1基因由27個外顯子和26個內含子組成，定位于13q14上，全長178 143 bp， 編碼序列(coding sequence，CDS)全長2 787 bp，編碼928個氨基酸[3]。RB1基因編碼的Rb蛋白含有3個結構域，即N端結構域、A/B口袋結構域和C端結構域[4]。Rb蛋白在細胞內磷酸化的程度與其生物學功能密切相關，例如低磷酸化或非磷酸化狀態的Rb可與E2F1結合形成復合物，阻止E2F1轉錄因子的釋放，使得E2F1介導的進入S期所必需的基因無法表達；而當Rb蛋白被CDK與周期蛋白復合物作用轉變為超磷酸化狀態時，Rb-E2F1復合物解離，釋放的E2F1作為轉錄因子調控下游靶基因的表達[5]。此外，Rb蛋白在細胞的凋亡、染色質重塑等方面也有重要的作用[6]。已經發現在依托泊苷誘導的細胞凋亡過程中，Rb被caspase裂解，去除掉C端的42個氨基酸殘基，產生一個100 ku的蛋白p100Rb[7]。在人骨肉瘤細胞Saos-2中也發現了一種突變的Rb蛋白p80Rb，其轉錄本與野生型Rb相比缺失了編碼C端的21～27外顯子[8]。目前尚無p100Rb和p80Rb相關生理功能的報道。為此，該研究構建了pcDNA3.1-p100Rb-FLAG和pcDNA3.1-p80Rb-FLAG真核表達載體，并過表達于HEK 293T細胞中，擬確定它們對細胞周期和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質粒、菌株與細胞 pcDNA3.1-RB1-FLAG和pcDNA3.1真核表達載體、TG1菌株、HEK 293T細胞均為安徽醫科大學生命科學學院范禮斌實驗室自存，U2OS細胞購于中國科學院上海細胞庫。

1.1.2主要儀器 Gelx-1620凝膠成像分析系統(上海歐翔科學儀器有限公司)；Axio Observer倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)；PTC-1148小型梯度PCR儀(上海伯樂生命醫學產品有限公司)；BSC-Ⅱ級生物安全柜(美國Thermo公司)；光吸收酶標儀(美國Molecular Devices公司)；CytoFlex流式細胞儀、Microfuge 20R高速冷凍離心機(美國Beckman公司)。

1.1.3主要試劑 胎牛血清(美國Clark公司)；DMEM培養基(澳洲Hyclone公司)；Opti-MEM低血清培養基、McCoy′s5a培養基(美國Thermo Fischer Scientific公司)；胰酶細胞消化液(含EDTA)、Western細胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、一抗稀釋液、Lipofectamine 8000脂質體轉染試劑(上海碧云天生物技術有限公司)；改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、BamHⅠ、XhoⅠ限制性內切酶、T4連接酶(上海生工生物有限公司)；DNA聚合酶(日本Takara公司)；膠回收、質粒小抽試劑盒(美國Axygen公司)； 0.2 μm PVDF膜(美國BIO-RAD 公司)；FLAG抗體F1804(美國Sigma公司)；辣根酶標記山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物有限公司)；Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；細胞周期PI染液(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1質粒構建 實驗所用PCR引物由通用生物系統(安徽)有限公司合成，序列見表1。以pcDNA3.1-RB1-FLAG真核表達質粒為模板，PCR擴增出含有FLAG標簽的p80Rb和p100Rb的CDS序列。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，利用膠回收試劑盒獲得純化的PCR產物。純化的PCR產物或pcDNA3.1載體用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內切酶雙酶切，酶切后的PCR產物和pcDNA3.1載體用T4連接酶連接，并用連接產物轉化TG1感受態細胞。轉化的感受態細胞置于含氨芐抗性的LB固體培養基中37 ℃培養約10 h，分別挑取數個單克隆至含有氨芐抗性的LB液體培養基中擴大培養約12 h，質粒抽提后，用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內切酶進行酶切鑒定，最后測序酶切正確的重組質粒。

表1 PCR引物序列表

1.2.2細胞培養 U2OS細胞使用含有10% FBS的McCoy′s5a培養基(100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中進行培養；HEK 293T細胞使用含有10% FBS的DMEM培養基(100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)。37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中進行培養。

1.2.3質粒瞬時轉染 將1×106個細胞接種于6孔板中，待細胞密度達到約70%～80%時，更換新鮮完全培養液。在無菌離心管中依次加入125 μl Opti-MEM?Medium、2.5 μg質粒DNA、4 μl Lipo8000TM轉染試劑，充分混勻后分別均勻滴入上述細胞培養孔內，輕輕混勻。細胞培養48 h后用于蛋白表達和流式細胞術分析，培養24 h后用于免疫熒光觀察。

1.2.4間接免疫熒光顯微術 取出有U2OS細胞蓋玻片，用預冷的PBS溶液清洗，-20 ℃預冷的甲醇固定10 min，封閉液(1%脫脂奶粉的TBST溶液)室溫封閉30 min，一抗溶液(1 ∶100)室溫孵育2 h，TRITC標記的二抗溶液(1 ∶100)室溫孵育1 h，DAPI染細胞核5 min，最后將蓋玻片固定至載玻片上，4 ℃保存過夜后，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5Western blot檢測 收集細胞沉淀并置于冰上裂解，20 min后收集蛋白裂解液，14 000 r/min離心20 min，收集上清液并測定蛋白含量，取適量蛋白上清液加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃變性7 min、冰浴3 min后，進行SDS-PAGE電泳，252 mA恒流電轉1.5 h將蛋白轉移至PVDF膜上，轉移后的PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1.5 h，加入相應的一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1.5 h，最后用ECL試劑盒顯色并在化學發光儀(Gelx-1620)上進行顯影。

1.2.6細胞周期 離心收集的細胞沉淀用預冷的PBS溶液清洗，逐滴加入500 μl預冷的70%乙醇 -20 ℃ 固定過夜，離心收集細胞，預冷的PBS溶液清洗，加入500 μl PI染液，4 ℃避光孵育15 min后用流式細胞儀檢測細胞周期，不同時相的細胞百分比用FlowJo軟件分析。

1.2.7細胞凋亡 離心收集的細胞沉淀用預冷的PBS溶液清洗，再用400 μl AnnexinV溶液與密度為106個/ml的懸浮細胞孵育，再加入5 μl Annexin V-FITC 染色液，4 ℃避光孵育15 min后，加入10 μl PI染色液4℃避光孵育5 min，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，用FlowJo軟件分析凋亡率。

2 結果

2.1 p100Rb和p80Rb真核表達載體的構建利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內切酶對構建的pcDNA3.1-p100Rb-FLAG和pcDNA3.1-p80Rb-FLAG質粒進行酶切鑒定，結果見圖1A。圖中可見，構建的質粒含有插入片段，而對照載體沒有。酶切鑒定正確的質粒經測序，證明構建質粒的插入片段是正確的，見圖1B、C。

圖1 pcDNA3.1-p100Rb-FLAG和pcDNA3.1-p80Rb-FLAG重組質粒的酶切鑒定與測序結果

2.2 p100Rb和p80Rb在U2OS細胞中的熒光定位分別轉染pcDNA3.1-p80Rb-FLAG和pcDNA3.1-p100Rb-FLAG至U2OS細胞，轉染后24 h將蓋玻片取出并進行免疫熒光制片，熒光顯微鏡下觀察p100Rb和p80Rb在U2OS細胞中的分布。結果表明p100Rb均主要分布在細胞核中，而p80Rb分布細胞質且聚集在核膜側，見圖2。

圖2 p100Rb和p80Rb在U2OS細胞中的熒光定位圖 ×400

2.3 p100Rb和p80Rb在HEK 293T細胞中的過表達將pcDNA3.1-RB1-FLAG，pcDNA3.1-p100Rb-FLAG和pcDNA3.1-p80Rb-FLAG真核表達質粒瞬時轉染至HEK 293T細胞中，轉染后48 h收集細胞并裂解，進行Western blot檢測。結果可見Rb、p100Rb和p80Rb分子量相應的條帶，而對照組(未處理和轉染pcDNA3.1載體的細胞裂解液)未見任何條帶，表明Rb、p100Rb和p80Rb在HEK 293T細胞中可以表達，見圖3。

圖3 p100Rb和p80Rb在HEK 293T細胞中的過表達

2.4 p100Rb和p80Rb對HEK 293T細胞周期的影響分別將pcDNA3.1-RB1-FLAG，pcDNA3.1-p100Rb-FLAG，pcDNA3.1-p80Rb-FLAG和pcDNA3.1轉染至HEK 293T細胞中，約48 h后收集細胞，分別進行PI單染，然后流式細胞儀檢測細胞周期(表2)。與pcDNA3.1載體對照組比較，Rb和p100Rb過表達組G1期百分比升高，差異有統計學意義(P<0.05)；p80Rb過表達G1期百分比無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)。表明過表達的Rb和p100Rb使HEK 293T細胞周期阻滯在G1期，而過表達的p80Rb對HEK 293T細胞周期無影響，見圖4。

表2 p100Rb和p80Rb對HEK 293T細胞周期的影響

圖4 p100Rb和p80Rb過表達后HEK 293T細胞的細胞周期圖

2.5 p100Rb和p80Rb對HEK 293T細胞凋亡的影響分別將pcDNA3.1-RB1-FLAG，pcDNA3.1-p100Rb-FLAG，pcDNA3.1-p80Rb-FLAG和pcDNA3.1轉染至HEK 293T細胞中，約48 h后收集細胞，分別進行Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染，然后流式細胞儀檢測凋亡(表3)。結果表明，與pcDNA3.1載體對照組比較，Rb、p100Rb和p80Rb過表達組細胞凋亡率降低，差異有統計學意義(P<0.05)，表明Rb、p100Rb和p80Rb能夠有效抑制HEK 293T細胞的凋亡，見圖5。

圖5 p100Rb和p80Rb過表達后HEK 293T細胞的凋亡圖

表3 Rb截短體對細胞的影響

3 討論

現已經發現Rb蛋白不僅在細胞周期調控方面起關鍵的作用，而且在染色質重塑、凋亡、衰老以及分化等方面也具有重要的作用[9]。細胞凋亡是細胞程序性死亡的過程，可誘導蛋白質水解和DNA斷裂[10]。用凋亡誘導劑依托泊苷處理后，Rb的C端 42個氨基酸被caspase切割產生p100Rb的截短體[7]。另外，早期的研究[8]表明Saos-2細胞中沒有全長的Rb蛋白，但是含有一個Rb蛋白的缺失突變體p80Rb(缺失21～27外顯子)。Rb蛋白定位于細胞核，其核定位信號為羧端的860KRSAEGSNPP KPLKKLR876[11]。p100Rb含有這個核定位序列，但p80Rb缺失這個序列，本研究結果也表明p100Rb定位在細胞核，而p80Rb定位在細胞質。Rb蛋白的口袋結構域可與E2F1結合，調控細胞周期的進程[12]。口袋結構域中的T373和S608/S612的磷酸化可導致與Rb蛋白結合的E2F1釋放出來，E2F1刺激進入S期的相關基因的表達，從而促進細胞進入S 期[12]。p100Rb含有完整Rb口袋結構域，能與E2F1結合；而p80Rb不含有完整的口袋結構域，不能與E2F1結合[7-8]。本研究結果表明p100Rb阻滯細胞周期進程，而p80Rb對細胞周期進程沒有影響，原因可能是前者能結合E2F1，而后者不能結合E2F1。

E2F1不僅能夠與Rb蛋白結合調控細胞周期的進程，還具有誘導細胞凋亡的功能[13]。研究發現E2F1不僅與口袋結構域結合，還可與Rb的C末端825～860氨基酸區域結合，該部位與E2F1誘導的凋亡反應有關[14]。本研究結果表明p80Rb和p100Rb抑制凋亡，而兩個截短體C端均缺失了E2F1的結合部位，提示它們的抗凋亡作用并不是通過E2F1進行的。近年來，發現Rb也可定位于線粒體，并通過與凋亡蛋白Bax的結合，直接誘導線粒體介導的凋亡[15]。p80Rb和p100Rb抑制凋亡表明這兩個蛋白可能并不與Bax結合。

綜上所述，過表達p100Rb阻滯HEK 293T細胞周期且抑制凋亡；過表達p80Rb對HEK 293T細胞周期無影響但可抑制凋亡。