雙硫侖協同奧沙利鉑誘導胃癌細胞鐵死亡

喻 鑫，劉 弋，周 波，曹先東

胃癌是致死率較高的一種消化道惡性腫瘤[1]，早期胃癌進行手術治療以及轉移性胃癌進行化療可使患者明顯獲益[2]。奧沙利鉑(oxaliplatin,Oxa)是臨床常用的胃癌化療藥物，但Oxa在臨床使用過程中經常出現耐藥且副作用多[3-4]。因此，當前急需探索新的治療方法來增加奧沙利鉑的治療效果，減少其毒副作用。

雙硫侖(disulfiram,DSF)是一種乙醛脫氫酶抑制劑，其作為一種解酒藥，已被報道具有抗腫瘤的作用[5]。研究[6]發現，DSF可通過抑制Wnt/β-catenin和NF-κB通路抑制胃癌細胞生長，DSF可通過上調活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)表達誘導惡性膠質瘤細胞鐵死亡[7]。DSF與多種化療藥物聯用可發揮協同作用，如DSF與多西他賽或順鉑聯用可協同抑制乳腺癌生長[8-9]。DSF與Oxa聯用能否發揮協同作用抑制胃癌細胞生長尚未見報道。該研究以人胃癌細胞BGC-823為研究對象，進行體外細胞實驗，旨在探索DSF與Oxa聯用的治療效果及作用機制，為DSF老藥新用治療胃癌提供線索，為臨床DSF與Oxa聯用治療胃癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞胃癌BGC-823細胞由中國科學技術大學生命科學院中心惠贈。

1.2 主要試劑RPMI 1640培養基、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素雙抗、BODIPY 581/591 C11dye (Invitrogen)購自美國賽默飛世爾科技公司；胎牛血清購自上海吉泰依科賽生物科技股份有限公司；DSF、Oxa、Z-VAD、NAC、Necro-1、Ferr-1購自上海藍木化工有限公司；AnnexinV/PI凋亡試劑盒、碘化吡啶購自上海碧云天生物技術有限公司；PCR逆轉錄試劑盒、PCR熒光定量試劑盒購自于北京寶日醫生物技術有限公司，Trizol試劑購自于美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 細胞培養將BGC-823細胞培養于37 ℃，5% CO2恒溫培養箱中以1640培養基(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗)培養，每天顯微鏡下觀察，2～3 d更換一次培養基，細胞傳代時用0.25%胰蛋白酶消化，取對數生長期細胞為實驗用細胞。

1.4 CCK-8檢測細胞活力取對數生長期細胞計數后，調整細胞密度為2×105/ml，接種于96孔板內，待細胞貼壁后，梯度稀釋藥物，實驗分為Oxa組、DSF組、Oxa+DSF組和空白組。Oxa組給予不同濃度(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L) Oxa處理，DSF組給予不同濃度(0、8、16、32、64、128、256 μmol/L)DSF處理,Oxa+DSF組中每組的Oxa給藥濃度與單用組相同，Oxa與DSF給藥濃度比為1 ∶1.6。各組加藥，每組設3個復孔，待不同濃度的DSF與Oxa處理BGC-823細胞24、48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細胞培養箱培養1～3 h后，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度(optical density,OD)，根據OD值計算細胞活力，使用Compu Syn軟件做協同作用曲線。

1.5 NAC、Z-VAD、Necro-1、Ferr-1抑制對細胞活力的回復實驗應用凋亡抑制劑Z-VAD、壞死性凋亡抑制劑Necro-1、鐵死亡抑制劑Ferr-1和活性氧抑制劑NAC進行細胞活力回復實驗。實驗分為DMSO對照組、NAC組(5 mmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+NAC組；實驗分為DMSO對照組、Z-VAD組(40 μmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+Z-VAD組；實驗分為DMSO對照組、Necro-1組(20 μmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+ Necro-1組；實驗分為DMSO對照組、Ferr-1組(5 μmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+Ferr-1組。取對數生長期細胞計數后，調整細胞密度為2×105/ml,接種于96孔板內，待細胞貼壁后，加入不同濃度藥物處理24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細胞培養箱培養1～3 h后，用酶標儀檢測450 nm處的OD值，根據OD值計算細胞活力。

1.6 Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡實驗分為DMSO對照組、NAC組(5 mmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+NAC組。取處于對數生長期的BGC-823細胞胰酶消化后接種于6孔板內，待6～12 h細胞貼壁后棄去培養基，每組加入新的含藥培養基處理24 h，之后吸棄培養基，用不含EDTA的胰酶消化BGC-823細胞后收集細胞于EP管內，用預冷的PBS清洗一遍，離心后每管加入500 μl 1×Binding Buffer重懸細胞轉入流式細胞管，每管加入5 μl AnnexinV-FITC避光10 min后，加入5 μl PI染色，混勻避光室溫反應10～15 min，之后于流式細胞儀上機檢測。

1.7 BODIPY 581/591 C11 dye (Invitrogen) 染色檢測脂質過氧化自由基(lipid ROS,LipROS)水平實驗分為DMSO對照組、Ferr-1組(5 μmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組、Oxa+DSF+Ferr-1組， 取對數生長期細胞計數后，調整細胞密度為2×105/ml， 接種于6孔板內，待細胞貼壁后，加入不同濃度藥物處理24 h后棄去培養基，每孔加入提前稀釋好的含BODIPY 581/591 C11的新鮮培養基，放入培養箱培養10 min左右，胰酶消化細胞之后轉入流式細胞管上機檢測。

1.8 qRT-PCR實驗設置DMSO對照組、Ferr-1組(5 μmol/L)、Oxa組(60 μmol/L)、DSF組(40 μmol/L)、Oxa+DSF組，取對數生長期細胞計數后，調整細胞密度為2×105/ml， 接種于6孔板內，待細胞貼壁后，加入不同濃度藥物處理BGC-823細胞24 h后棄去培養基，用TRIzol法提取總RNA，使用Takara逆轉錄試劑盒用兩步法逆轉錄成cDNA，用Takara熒光定量試劑盒進行實時熒光定量PCR反應。引物序列見表1。

表1 引物序列表

2 結果

2.1 DSF與Oxa聯用抑制BGC-823細胞活力CCK-8檢測細胞活力結果顯示，不同濃度的DSF、Oxa處理BGC-823細胞24、48、72 h后，DSF、Oxa均能時間與劑量依耐性抑制BGC-823細胞活力(圖1A、B)。DSF與Oxa聯用時，DSF能明顯增強Oxa對BGC-823細胞活力抑制效果(F=382.37,P<0.001，圖1C)；用CompuSyn軟件做Farction-Effect協同作用曲線，結果顯示所有的聯合指數(combination index,CI)值都小于1 (CI<1)，表明DSF與Oxa聯用聯用有很好的協同作用(圖1D)。

圖1 DSF與Oxa對BGC-823細胞活力的影響

2.2 DSF與Oxa聯用誘導BGC-823細胞凋亡和鐵死亡本實驗使用了凋亡抑制劑Z-VAD、壞死性凋亡抑制劑Necro-1、鐵死亡抑制劑Ferr-1和活性氧抑制劑NAC進行細胞活力回復實驗。結果顯示：Z-VAD處理能部分逆轉DSF與Oxa聯用誘導的細胞活力抑制(F=67.62,P<0.05,圖2A)；Necro-1處理不能逆轉DSF與Oxa聯用誘導的細胞活力抑制(F=1.52,P>0.05,圖2B)；Ferr-1處理能完全逆轉DSF與Oxa聯用誘導的細胞活力抑制(F=397.54,P<0.001,圖2C)；NAC能逆轉DSF與Oxa聯用誘導的細胞活力抑制(F=382.62,P<0.001,圖2D)。流式細胞術檢測細胞凋亡結果也表明NAC能部分逆轉DSF與Oxa聯用引起的細胞凋亡(F=368.12,P<0.001,圖3)。上述結果表明DSF與Oxa聯用可部分引起BGC-823細胞凋亡和鐵死亡。

2.3 鐵死亡抑制劑Ferr-1能逆轉DSF聯合Oxa誘導胃癌細胞鐵死亡進一步用流式細胞術檢測鐵死亡抑制劑Ferr-1是否能逆轉DSF與Oxa聯用后引起的胃癌細胞死亡。結果顯示Ferr-1預處理BGC-823細胞后，DSF與Oxa聯用引起BGC-823細胞死亡(PI陽性)明顯減少，Ferr-1能逆轉DSF與Oxa聯合誘導的胃癌細胞鐵死亡(F=402.52,P<0.001,圖4)，顯然，DSF與Oxa聯用能誘導胃癌細胞鐵死亡。

圖4 鐵死亡抑制劑Ferr-1預處理BGC-823細胞后用DSF與Oxa單用或聯用24 h后檢測BGC-823細胞凋亡情況

2.4 DSF聯合Oxa誘導BGC-823細胞鐵死亡的分子機制LipROS BODIPY 581/591 C11染色流式細胞術檢測結果顯示，DSF與Oxa聯用能明顯誘導LipROS產生增多，鐵死亡抑制劑Ferr-1預處理BGC-823細胞后，明顯抑制DSF與Oxa聯用誘導的BGC-823細胞LipROS產生增多(F=530.36,P<0.001,圖5A、B)；qRT-PCR結果顯示，DSF與Oxa聯用可引起促鐵死亡調控基因PTGS2 mRNA表達水平上調(圖5C)，抑鐵死亡調控基因GPX4和SLC7A11 mRNA表達水平下調(F=462.56,P<0.001,圖5D、E)。上述結果表明DSF與Oxa聯用明顯促進LipROS產生增多，上調PTGS2 mRNA表達水平，下調GPX4和SLC7A11 mRNA表達水平，誘導胃癌細胞BGC-823細胞鐵死亡。

圖5 DSF與Oxa聯用誘導BGC-823細胞鐵死亡

3 討論

Oxa作為第三代鉑類藥物，對轉移性胃癌有很好的效果，在臨床使用中由于易發生耐藥和毒副作用，目前仍有許多局限性[10]，聯合用藥是一種很好的增效減毒的方法，因此急需找到有效的可增敏Oxa的藥物。DSF為常見的戒酒藥，二價過渡金屬離子螯合劑，具有價格低廉、細胞毒性及良好的抗腫瘤效果等優勢，有望作為抗腫瘤藥物應用于臨床[11]。DSF可通過抑制Wnt/β-catenin和NF-κB等通路抑制胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲[6]。另有研究[12]發現，DSF與多種化療藥物聯用可協同抑制腫瘤生長，如DSF與銅(Cu)聯合作用可通過下調Casepas-3蛋白表達、上調Casepas-8蛋白，進而通過上調自噬相關蛋白抑制胃癌細胞凋亡而發揮抑制胃癌生長作用；DSF與Cu聯合作用也可以通過調控應激反應和Wnt/β-catenin信號通路發揮抗腫瘤作用[13]；DSF與多西他賽或順鉑聯用可協同抑制乳腺癌生長[8-9]。DSF聯用Oxa是否能發揮對胃癌細胞生長起協同作用不清楚，同時兩者聯用的作用機制也有待闡明。本研究以BGC-823細胞為實驗對象，通過CCK-8實驗檢測細胞活力、流式細胞術檢測細胞凋亡和LipROS變化情況及qRT-PCR來探索DSF與Oxa聯用可誘導BGC-823細胞鐵死亡。

本研究發現，DSF與Oxa聯用可時間和劑量依賴性抑制BGC-823細胞活力。為了探索DSF與Oxa聯用的作用機制，本研究使用凋亡抑制劑Z-VAD、壞死性凋亡抑制劑Necro-1、鐵死亡抑制劑Ferr-1和活性氧抑制劑NAC,進行了細胞活力回復實驗。發現DSF與Oxa聯用可部分誘導BGC-823細胞凋亡，活性氧抑制劑NAC可以逆轉DSF與Oxa聯用誘導BGC-823細胞凋亡。鐵死亡是一種區別于細胞凋亡、細胞壞死、細胞焦亡、細胞自噬的新型細胞程序性死亡方式[14]，其是一種鐵依賴的脂質過氧化引發的新的死亡方式[15]，鐵死亡過程中常出現LipROS[16]，同時促鐵死亡標記物PTGS2表達上升和抑鐵死亡標記物GPX4、SLC7A11水平表達下調[17]。本研究發現鐵死亡抑制劑Ferr-1可在一定程度上逆轉DSF與Oxa聯用引起的BGC-823細胞活力下降和細胞死亡，同時鐵死亡抑制劑Ferr-1能部分逆轉DSF與Oxa聯用引起的BGC-823細胞LipROS產生增多，表明兩藥聯用主要是通過誘導LipROS產生增多促進BGC-823細胞發生鐵死亡。qRT-PCR結果也進一步提示DSF與Oxa聯用可上調促鐵死亡PTGS2 mRNA表達水平和下調抑鐵死亡GPX4和SLC7A11 mRNA表達水平，誘導BGC-823細胞鐵死亡。

綜上所述，本研究發現DSF與Oxa發揮明顯協同作用誘導BGC-823胃癌細胞鐵死亡。DSF與Oxa聯用誘導胃癌細胞鐵死亡將為臨床DSF老藥新用提供線索，為DSF與Oxa聯合用藥治療胃癌提供理論指導。