基于16S rDNA測(cè)序技術(shù)分析利福平致大鼠肝損傷中腸道菌群變化特征

楊璐銘，郝金奇,2，王 林，裴盛斐，郭 玉，唐琴艷，李 玥，高學(xué)磊，李玉紅,4，郝明媛，馮福民,

利福平(rifampicin,RFP)是WHO推薦使用的一線抗結(jié)核藥物之一，然而經(jīng)RFP治療的結(jié)核病患者會(huì)出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶升高、輕度肝炎、肝臟膽汁淤積等肝損傷表現(xiàn)[1]。這種抗結(jié)核藥物性肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ADLI)已成為結(jié)核病治療中的一大難題，腸道微生物組學(xué)研究的進(jìn)展為ADLI的預(yù)防和治療提供了新思路。

人類腸道微生物群由1 000多種細(xì)菌組成[2]。腸道菌群處于生態(tài)平衡狀態(tài)時(shí)可以抵抗致病菌并且防止致病菌過度繁殖，但當(dāng)大量使用抗生素或抗菌藥物后，腸道菌群的生態(tài)平衡被破壞，進(jìn)而通過腸-肝軸調(diào)控肝臟疾病的進(jìn)展[3]。此外，腸道菌群也可通過分泌對(duì)甲酚來降低對(duì)乙酰氨基酚的磺化作用，進(jìn)而導(dǎo)致藥物性肝損傷的發(fā)生[4]。而RFP治療后的腸道菌群變化特征與ADLI的發(fā)生是否有關(guān)聯(lián)仍需研究。該研究使用16S rDNA測(cè)序技術(shù)分析RFP致ADLI大鼠模型中腸道菌群的變化特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，6～8周齡、體質(zhì)量180～250 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大鼠自由進(jìn)食與飲水，交替照明各12 h，溫度24 ℃左右，相對(duì)濕度60%～80%。本研究已獲華北理工大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批文號(hào)：LX2018137)。

1.2 主要試劑RFP購自日本TCI公司，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 RFP灌胃液配制稱取RFP粉末1.2 g溶解于60 ml生理鹽水中，配置成濃度為20 mg/ml的RFP灌胃液。

1.4 動(dòng)物分組24只SD雄性大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對(duì)照組(D0組，n=8)、RFP灌胃10 d組(R10組，n=8)、RFP灌胃28 d組(R28組，n=8)。對(duì)照組大鼠在0 d處死，其余兩組給予100 mg/(kg·d) RFP灌胃，分別于連續(xù)灌胃10 d和28 d后處死各組所有大鼠。

1.5 標(biāo)本采集末次給藥24 h后，收集大鼠新鮮糞便顆粒于5 ml無菌凍存管中，置于-80 ℃保存。處死大鼠，取肝組織，經(jīng)HE染色后觀察組織形態(tài)。

1.6 ALT、AST檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在96孔板中加入ALT、AST基液和血清，37 ℃孵育30 min，各孔中加入2,4-二硝基肼，37 ℃孵育20 min，各孔加入NaOH，室溫靜置。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(optical density,OD)值。

1.7 16S rDNA測(cè)序使用隨機(jī)數(shù)字表法每組選取4只大鼠的糞便標(biāo)本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。設(shè)計(jì)16S rDNA V3～V4區(qū)域的引物，引物序列為F：5′-NNNNCCTA-CGGGNGGCWGCAG-3′、R：5′-NNNNGGACTACHVG-GGTATCTAATCC-3′，擴(kuò)增16S rDNA片段，將獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，采用Qubit 2.0測(cè)定純化后的PCR擴(kuò)增子濃度，構(gòu)建cDNA文庫，使用IlluminaMiSeq平臺(tái)來測(cè)序。

1.8 腸道菌群測(cè)序結(jié)果分析Alpha多樣性分析采用Sobs指數(shù)和Shannon指數(shù)；β多樣性分析采用主坐標(biāo)分析(principalco-ordinatesanalysis,PCoA)，并使用相似性分析(analysisofsimilarities,Anosim)來評(píng)估組間差異；分別從門和屬水平比較各組大鼠腸道菌群組成。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用STAMP和R軟件進(jìn)行組間差異分析。STAMP軟件中的ANOVA檢驗(yàn)和Rstats包中的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)用于多組間差異分析，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)用于兩組間差異分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織HE染色結(jié)果D0組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)完整，整齊排列，細(xì)胞核大小正常；R10組肝細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞質(zhì)疏松，伴有氣球樣變和點(diǎn)狀壞死；R28組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，大面積肝細(xì)胞溶解性壞死且部分細(xì)胞核染色變深。見圖1。與R0組比較，R10組和R28組ALT、AST水平升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。表明隨著RFP灌胃時(shí)間的延長，肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷現(xiàn)象，大鼠ADLI造模成功。

表1 三組大鼠血清ALT、AST水平變化

圖1 三組大鼠肝組織病理學(xué)光鏡圖 ×200

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化Sobs指數(shù)和Shannon指數(shù)可以反映群落物種數(shù)量和群落多樣性，D0組、R10組、R28組Sobs指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Shannon指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。通過PCoA圖對(duì)腸道菌群進(jìn)行β多樣性分析，可以直觀的看到D0組、R10組、R28組明顯分開，而各組組內(nèi)樣本呈現(xiàn)聚集現(xiàn)象，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)分別解釋了總變量的33.93%和23.35%；結(jié)合Anosim分析，三組大鼠組內(nèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，各組間腸道菌群結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。說明在RFP致大鼠肝損傷過程中改變了腸道菌群結(jié)構(gòu)及其豐富度，而多樣性未發(fā)生改變。

圖2 三組大鼠腸道菌群的Alpha多樣性

圖3 三組大鼠腸道菌群的PCoA圖

2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠腸道菌群物種組成分析根據(jù)OUT物種注釋結(jié)果，三組大鼠在門水平上主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和Proteobacteria構(gòu)成，其中Firmicutes和Bacteroidetes占細(xì)菌總數(shù)的85%以上，在三組中均豐度最高。Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在三組中豐度變化有差異的是Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Verrucomicrobia。與D0組大鼠比較，隨著給予RFP藥物時(shí)間的延長，Bacteroidetes豐度增加，F(xiàn)irmicutes豐度減少，Actinobacteria豐度先增加后減少，Verrucomicrobia豐度先減少后增加(P<0.05)。其中Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria豐度變化較明顯，D0組、R10組、R28組Firmicutes豐度分別為72%、53%、32%；Bacteroidetes豐度分別為17%、33%、61%；Actinobacteria豐度分別為4%、16%、2%。進(jìn)一步兩兩比較，與D0組比較，R10組Firmicutes和Patescibacteria豐度減少，R28組Firmicutes和Actinobacteria豐度減少，Bacteroidetes豐度增加(P<0.05)；與R10組比較，R28組Actinobacteria豐度減少(P<0.05)。見圖4。

圖4 三組大鼠腸道菌群在門水平的組成及差異分析

在屬水平上，三組大鼠糞便樣本中共有Lactobaclllus、Bifidobacterium、Romboutsia等21個(gè)屬，Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果顯示，三組大鼠腸道菌群相對(duì)豐度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的屬共15個(gè)。與D0組比較，隨著給予RFP藥物時(shí)間的延長unclassified_f_Prevotellaceae、Blautia、Prevotellaceae_NK3B31_group、Erysipelotrichaceae_uCG-003、Fournierella豐度增加，Lactobacillus、Romboutsia、Ruminococcaceae_uCG-014豐度減少，Bifidobacterium、Dubosiella、Faecalibaculum豐度先增加后減少，Alloprevotella、Akkermansia、Prevotellaceae_Ga6A1_group、Ruminococcus_1豐度先減少后增加(均P<0.05)，其中Lactobacillus豐度變化較為明顯，D0組、R10組、R28組Lactobacillus豐度分別為52%、34%、8%；與D0組比較，R10組Dubosiella、unclassified_f_lachnospiraceae、Faecalibaculum豐度增加，R28組norank_f_Muribaculaceae、Ruminococcus_1豐度增加，Lactobacillus豐度減少；與R10組比較，R28組Lactobacillus、Faecalibaculum豐度減少，Ruminococcus_1豐度增加(P<0.05)。見圖5。

圖5 三組大鼠腸道菌群在屬水平的組成及差異分析

3 討論

腸道菌群是衡量機(jī)體健康程度及水平的指標(biāo)之一，已有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群多樣性與多種疾病有關(guān)。本研究選擇16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)RFP誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型中的腸道菌群多樣性進(jìn)行分析，其結(jié)果能夠有效解釋糞便標(biāo)本中腸道菌群的物種分布、豐度、差異以及進(jìn)化關(guān)系，為RFP誘導(dǎo)的ADLI機(jī)制研究提供了新的視角，為ADLI的預(yù)防及治療提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

腸道是微生物群的天然棲息地，菌群可以通過各種途徑發(fā)揮作用。有益菌群，比如糞球菌屬(Coprococcus)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)、羅氏菌屬(Rothia)等，可以通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸而使宿主受益[5]。在本研究中，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在RFP構(gòu)建的大鼠ADLI模型中是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，隨著給予RFP藥物時(shí)間的延長，Bacteroidetes豐度增加，F(xiàn)irmicutes豐度減少，雖然影響了其組成比例，但未影響優(yōu)勢(shì)菌群的種類。Firmicutes和Bacteroidetes在不同的肝臟疾病均被證實(shí)可以影響疾病的進(jìn)展，比如，Bacteroidetes減少，放線菌門(Actinobacteria)的增加，會(huì)導(dǎo)致肝病的惡化[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在酒精性肝病發(fā)生后，起到抗炎和保護(hù)黏膜作用的Firmicutes呈現(xiàn)顯著降低[7]。大鼠給予RFP灌胃后，Bacteroidetes豐度增加，說明Bacteroidetes參與了ADLI發(fā)生，但因果關(guān)系尚不明確。

同樣的，有研究報(bào)道指出腸道微生物群對(duì)藥物的代謝有直接和間接的影響[8]，這導(dǎo)致腸道菌群中有益菌群和致病菌群豐度變化程度不同，這可能是Actinobacteria豐度先增加后減少的原因，進(jìn)一步的，在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)在ADLI大鼠腸道中Lactobacillus數(shù)量減少，Lactobacillus作為一種有益共生菌屬，可增強(qiáng)小鼠肝臟的核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2活性，進(jìn)而起到保護(hù)肝臟免受氧化性損傷[9]。在慢性肝炎患者和全身炎癥反應(yīng)綜合征患者糞便中均表現(xiàn)出致病菌數(shù)量增加，Bifidobacterium和Lactobacillus等有益菌的數(shù)量減少[10-11]，與本研究結(jié)果一致。

本研究通過對(duì)大鼠腸道菌群的分析，證實(shí)了RFP致ADLI的發(fā)生改變了大鼠腸道菌群的豐度，未改變其多樣性，菌群的結(jié)構(gòu)和組成均發(fā)生了改變，有益菌減少，致病菌增多。本研究對(duì)大鼠的飼養(yǎng)過程進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)量控制，提升了腸道菌群與ADLI之間聯(lián)系的可靠性，然而大鼠的飼養(yǎng)時(shí)間也可能是一個(gè)影響因素，未能在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置空白對(duì)照組是本研究的局限性。腸道菌群數(shù)量較多，組成復(fù)雜，探究關(guān)鍵菌群在ADLI中如何發(fā)揮作用仍是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。