抗生素對大鼠腸道菌群和認知行為的影響

李艷麗，楊小榮，張 策，郭軍紅

在人體腸道生活著100萬億個微生物，是人體細胞總數的10倍，被稱為腸道微生物或腸道菌群[1]。抗生素作為干預腸道菌群的主要方式之一，會引起腸道菌群失調，影響認知行為。研究[2]表明，聯合抗生素(氨芐青霉素、桿菌肽、美羅培南、新霉素和萬古霉素)處理可使小鼠新物體識別記憶受損。氨芐青霉素處理引起小鼠空間記憶和新物體識別記憶缺陷[3]。但是這些研究并未報道抗生素處理后腸道菌群是否恢復以及對認知行為的長期影響。該研究通過4種廣譜抗生素聯合應用觀察大鼠腸道菌群的改變、恢復及對認知行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組3月齡SPF級雄性SD大鼠(n=12)，體質量280～300 g，購自長沙天勤生物技術有限公司[許可證號為SCXK(湘)2014-0010]。所有大鼠在山西醫科大學實驗動物中心飼養，每籠2只，環境溫度20～22 ℃，濕度50%，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。食物和水經高壓滅菌，所有動物自由進食和水。

實驗大鼠隨機分兩組，每組6只。一組為抗生素處理(AT)組，用抗生素混合液灌胃3 d。抗生素混合制劑為：氨芐青霉素[180 mg/(kg·d)，山東魯抗醫藥股份有限公司]，萬古霉素[72 mg/(kg·d)，華北制藥股份有限公司]，甲硝唑[90 mg/(kg·d)，陜西必康制藥集團控股有限公司]和亞胺培南[90 mg/(kg·d)，杭州默沙東制藥有限公司]，每天2次(間隔12 h)，每次灌胃2 ml，持續3 d，之后常規飼養至2個月。另一組為對照(Control)組，灌胃等量的生理鹽水持續3 d，之后常規飼養至2個月。在第4天(距最后一次抗生素處理24 h)收集糞便進行腸道菌群檢測。在2個月時進行腸道菌群和認知行為的檢測。

1.2 糞便樣本采集在第4天(距最后一次抗生素處理24 h)和2個月時分別收集糞便進行腸道菌群檢測。采集糞便前，紫外消毒通風櫥處理30 min。采集時，帶上無菌手套，在通風櫥收集大鼠糞便0.5～10 g，裝入無菌凍存管，立即放在冰上并做好標記，迅速放入液氮中，收集完后立即放入-80 °C冰箱保存。

1.3 16s rRNA基因測序用糞便DNA提取試劑盒(生產批號154041641，德國Qiagen公司)提取各樣本微生物組總DNA，委托上海派森諾生物科技股份有限公司在Illumina MiSeq高通量測序平臺進行高通量測序。使用QIIME2軟件和VSEARCH軟件進行序列去噪和可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類。使用R軟件包(v3.1.1)計算OTU數量和Shannon多樣性指數。使用R軟件包進行基于加權UniFrac距離的非度量多維尺度(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)分析，顯示樣本間OTU組成的差異。使用RDP Classifier軟件v.2.2對OTU代表性序列進行物種水平的分類，置信閾值80%。在R(v3.1.1)軟件進行統計分析[4]。

1.4 基于操作條件反射的延遲匹配樣本任務(delayed matching to position，DMTP)檢測在操作條件反射測試室(MED-007-CT，美國Med Associates公司，圖1A)，通過基于操作條件反射的DMTP檢測大鼠的工作記憶(圖1B)。在訓練開始前5 d，限制大鼠飲食，使其體質量維持在原體質量的80%～85%，但不限制飲水，直至行為實驗結束。

訓練階段程序：① 首先進行食槽訓練，每次實驗時長64 min，包括38粒食物顆粒，間隔(100±40)s；② 壓桿訓練，每次隨機伸出左桿/右桿，老鼠壓桿后獲得一次食物獎勵，每次實驗時長30 min，包含50次壓桿。

延遲匹配任務：包括3個階段即樣本階段、延遲階段和選擇階段(圖1B)。樣本階段：房燈亮，實驗開始，一個桿伸出(左右隨機，此桿為“sample”桿)，老鼠壓桿，桿回縮，開始計時延遲。延遲階段：鼠要鼻觸食槽，延遲后的第1次鼻觸，左右兩桿同時伸出，進入選擇階段。選擇階段：① 鼠壓正確桿(樣本階段“sample”桿為正確桿)，兩桿回縮，獎勵食物顆粒，5 s間隔后，進行下一次測試；② 鼠壓錯誤桿，兩桿回縮，房燈滅5 s，即“timeout”期。開始訓練時，延遲設為0 s。如果連續2次實驗正確率達80%以上，進入延遲。延遲1，延遲設為0 s、1 s、2 s、3 s、4 s、5 s、6 s，7個延遲為一組(block)，一組中每個延遲隨機出現且每個延遲只出現一次，7個延遲后進入下一組。如果連續2次實驗正確率達80%以上，進入延遲2。延遲2設為0 s、1 s、2 s、4 s、8 s、12 s、16 s。如果連續2次實驗正確率達80%以上，開始測試實驗，延遲設為0 s、2 s、4 s、8 s、12 s、18 s、24 s，連續測試5個實驗，記錄每個延遲的正確率。在抗生素處理后2個月時進行測試實驗。

圖1 基于操作條件反射的DMTP

1.5 Y迷宮檢測Y迷宮(XR-XY1032，上海欣軟信息科技有限公司)共3個臂，各個臂夾角120°，每一臂尺寸60 cm×10 cm×35 cm(長×寬×高)。實驗時在迷宮各個臂內貼上不同幾何圖形，作為視覺標記。Y迷宮檢測大鼠的空間記憶。實驗分2個階段。第1個階段為訓練期，用隔板擋住一個臂(此臂為新異臂)，大鼠由起始臂背對迷宮的中心放入，在起始臂和其他臂自由探索10 min，然后取出；間隔1 h后，開始第2個階段為測試期，打開新異臂，大鼠仍由起始臂放入，在3個臂探索5 min。記錄大鼠進入每個臂的次數及在每個臂的持續時間。每次實驗的新異臂與起始臂隨機設置，且每組樣本新異臂在起始臂的左側和右側動物數相等。在抗生素處理后2個月時進行。

2 結果

2.1 抗生素處理減少大鼠腸道菌群數量用氨芐青霉素、萬古霉素、甲硝唑和亞胺培南4種抗生素聯合處理3 d可減少大鼠腸道菌群數量。與Control組比較，AT組大鼠腸道菌群OTU數量明顯減少(見圖2A)。

從Rarefaction稀疏曲線可以看出，隨測序量不斷增加，稀疏曲線變緩，序列深度足夠，可以反映當前樣品所包含的多樣性(見圖2B)。Control組大鼠Shannon指數為(7.93±0.41)，AT組大鼠Shannon指數(3.64±0.57)降低，差異有統計學意義(t=13.18，P<0.000 1)。

基于UniFrac距離的NMDS結果表明，AT組大鼠腸道菌群(AT-1)與Control組(Control-1)不同(見圖2C)。在門水平，共檢測出15個門。其中擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)之和占0.90以上，是大鼠糞便中主要的優勢菌門。與Control組比較，AT組Bacteroidetes減少，差異有統計學意義(t=9.891，P<0.000 1，見圖2D)；Firmicutes減少，差異有統計學意義(t=7.397，P=0.000 1，見圖2D)；而變形菌門(Proteobacteria)增加，差異有統計學意義(t=18.37，P<0.000 1，見圖2D)。在屬水平，AT組大鼠Prevotella、Blautia、Phascolarctobacterium、Sutterella、Bacteroides、Ruminococcus、Parabacteroides數量減少(見圖2E、F)。

圖2 第4天AT組和Control組大鼠的腸道菌群差異

2.2 抗生素處理后2個月大鼠腸道菌群恢復抗生素處理后2個月AT組大鼠腸道菌群OTU數量恢復，與Control組比較差異無統計學意義(見圖3A)。腸道菌群多樣性也恢復，Control組Shannon指數為(8.83±0.24)，AT組Shannon指數為(9.13±0.34)，兩組比較差異無統計學意義(見圖3B)。

圖3 抗生素處理后2個月AT組和Control組大鼠的腸道菌群

基于UniFrac距離的NMDS結果表明，抗生素處理后2個月AT組(AT-2)腸道菌群可以恢復，與Control組(Control-2)比較差異無統計學意義(見圖2C)。在門水平，2個月后擬桿菌門和厚壁菌門數量恢復，與Control組比較差異無統計學意義(見圖3C)。在屬水平，2個月后Prevotella、Ruminococcus、Bacteroides、Sutterella、Phascolarctobacterium數量恢復，與Control組比較差異無統計學意義(見圖3D)。

2.3 抗生素處理對工作記憶的影響通過基于操作條件反射的DMTP檢測Control組和AT組大鼠的認知行為。結果顯示，隨著延遲的增加，Control組和AT組大鼠的正確壓桿率均減少。Control組大鼠在0 s、2 s、4s、8 s、12 s、18 s、24 s延遲的正確壓桿率分別為100.0%、99.5%、98.8%、93.0%、88.3%、81.5%、80.8%；AT組大鼠在0 s、2 s、4 s、8 s、12 s、18 s、24 s延遲的正確壓桿率分別為98.8%、99.0%、96.0%、91.2%、83.7%、83.0%、77.3%。在各延遲，兩組大鼠的正確壓桿率比較差異無統計學意義(F=3.029,P=0.112，見圖4)。

圖4 利用DMTP檢測Control組和AT組大鼠的工作記憶

2.4 抗生素處理對空間記憶的影響大鼠在探索Y迷宮新異臂的次數和時間反映其空間記憶功能。Y迷宮檢測結果顯示，兩組大鼠探索新異臂的次數和時間比較差異無統計學意義。Control組大鼠探索新異臂次數占總探索次數的比率為(0.43±0.01)，AT組為(0.46 ±0.02)，兩組比較差異無統計學意義(t=1.131，P=0.284，見圖5A)。同樣，Control組大鼠探索新異臂的時間占總探索時間的比率為(0.54± 0.03)，AT組為(0.56±0.03)，兩組比較差異無統計學意義(t=0.381，P=0.711，見圖5B)。

圖5 利用Y迷宮檢測Control組和AT組大鼠的空間記憶

3 討論

健康成年人的腸道菌群有兩個主要門：擬桿菌門和厚壁菌門，占0.90以上；其次為放線菌門、變形菌門、梭桿菌門和疣微菌門[5]。腸道菌群為人類的“第2基因組”，從出生開始定植于人體腸道[6]。微生物與宿主互利共生，在營養代謝、維持腸黏膜屏障功能和免疫調節中起著重要作用[7-8]。

腸道菌群在調控大腦功能及行為中發揮重要作用，因此提出了“微生物-腸-腦軸”的概念[9-10]。抗生素處理影響正常腸道菌群的數量和結構，引起菌群失調。研究[3]表明，氨芐青霉素處理的小鼠厚壁菌門數量減少，引起小鼠Morris水迷宮空間記憶和新物體識別記憶缺陷。萬古霉素和氨芐青霉素處理短暫性前腦缺血小鼠會增加變形菌門的數量，加重其在Y迷宮、新物體識別和巴恩斯迷宮任務中的認知功能損害[11]。另一項研究[2]用氨芐青霉素、桿菌肽、美羅培南、新霉素和萬古霉素5種抗生素組合處理的小鼠腸道菌群數量減少和細菌多樣性下降，引起小鼠新物體識別記憶受損。這些研究表明一種抗生素或抗生素組合短期處理可能破壞腸道菌群而影響認知功能，但是停用抗生素后腸道菌群是否會恢復以及對認知行為是否有長期影響并未見報道。

本研究應用氨芐青霉素、萬古霉素、甲硝唑和亞胺培南4種抗生素聯合處理，觀察到抗生素抑制大鼠腸道菌群，引起腸道菌群多樣性減少，優勢菌擬桿菌門和厚壁菌門數量均減少。與之前的研究[2]結果一致，氨芐青霉素、萬古霉素、甲硝唑和和亞胺培南組合可以非選擇性的去除腸道微生物，引起優勢菌的普遍下調。因此，本研究進一步證實短期使用抗生素處理是一種有效的模型，可以探索微生物群及其依賴性腦功能和行為變化的因果關系。除了抗生素處理，無菌(germ free，GF)動物也是研究腸道菌群的一個有利工具[12]。因為GF動物不含有任何菌群，可以單獨引入某一菌株來觀察其對宿主健康的作用，或通過移植患者(或疾病模型動物)的糞便微生物來觀察腸道菌群對疾病發生發展的影響。但是GF動物表現為永久性神經發育和認知行為缺陷[13]，因此當前GF動物的相關研究仍有一些值得改進的地方。與GF動物研究比較，本研究證實廣譜抗生素的短期應用并不會對認知行為造成長期影響。本研究結果進一步支持，通過廣譜抗生素處理抑制宿主腸道菌群，然后移植患者或疾病模型動物的糞便微生物來觀察其對認知功能的作用是一種更為理想的模型。