SETDB1通過p53/p21通路調控結腸癌細胞衰老

吳 倩，侯吉學，賀 強，崔曉賓，黃桂林，孫旭凌

結腸癌在我國的發病率與死亡率分別居于第3位和第5位[1]。目前，針對結腸癌的靶向治療研究在臨床上受到越來越多的重視[2-3]，關于結腸癌發病機制的研究得到廣泛關注。研究[4]顯示，在部分相關腫瘤的發生及發展中，細胞衰老扮演著重要角色。結腸癌細胞中存在一種屬于組蛋白賴氨酸N端甲基轉移酶的組蛋白甲基化酶 SET結構域分支型1(SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，SETDB1)，其編碼基因的位置在人類染色體 1q21 上，其過度表達和下調廣泛存在于多種惡性腫瘤中[5-7]，但具體機制仍有待進一步的研究。鑒于課題組前期研究發現SETDB1可以影響細胞衰老[8]，遂以結腸癌細胞為研究對象，擬進一步探討SETDB1在結腸癌發生發展中的作用，為進一步闡明結腸癌發病機制和開發新的靶向治療策略提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料結腸癌細胞HT29、SW480由石河子大學醫學院第一附屬醫院病理科提供；多柔比星(doxorubicin,DOX)購于德國Sigma公司；衰老β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)試劑盒、CCK8 試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；轉染試劑購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；p53和p21抗體、SETDB1和GAPDH購于美國圣克魯斯生物技術(上海)有限公司；針對 SETDB1的 shRNA、過表達質粒與p53質粒購于上海吉凱基因化學技術有限公司；高糖培養基及嘌呤霉素等購于武漢啟動子生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1穩轉細胞系的建立 shRNA慢病毒用于感染預鋪在6孔板中的SW480細胞(每孔約5×104個細胞)，首先5 μg/ml慢病毒感染細胞12 h，其次將培養基更換成高糖培養基。感染 72 h后，再將培養基更換為含2 μg/ml 嘌呤霉素的培養基。之后每2 d更換含嘌呤霉素的培養基，直到對照細胞完全死亡。使用MD2-G、PAX、pLKO-SETDB1三包系統進行高表達病毒包裝，包裝好的慢病毒立即感染HT29細胞系。

1.2.2細胞衰老β-半乳糖苷酶染色 將高表達SETDB1的HT29細胞及對照組細胞、低表達SETDB1的SW480細胞及對照組細胞預鋪在6孔板中(每孔約5×104個細胞)，用DOX 0.25 μmol/L誘導不同組別的HT29細胞或SW480細胞，加β-半乳糖苷酶染色固定液1 ml，25 ℃靜置30 min，PBS沖洗3次。每孔均加1 ml染色工作液，封口膠封閉6孔板保存在無CO2的37 ℃溫箱中15 min，于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3CCK8檢測 將DOX預處理的HT29細胞及DMSO處理的對照組細胞、高表達SETDB1的HT29細胞及對照組細胞、低表達SETDB1的SW480細胞及對照組細胞鋪在96孔板中(每孔3 000個細胞)，設復孔3個。待細胞貼壁，分別于0、24、48、72 h后，將混有10 μl CCK8的培養基100 μl加入每孔當中，孵育2 h后，酶標儀檢測后繪制各時間點細胞生長曲線，比較細胞生長情況。

1.2.4Western blot檢測 用蛋白裂解液提取不同處理組的細胞蛋白，計算好蛋白樣品濃度及上樣量。加樣以SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，濕轉至PVDF膜，封閉孵育一抗1 h，4 ℃ 7 h，第2天孵育對應的二抗2 h，TBST洗30 min，利用ECL發光劑在曝光機下拍照。

1.2.5細胞周期檢測 將DOX預處理的HT29細胞及DMSO處理的對照組細胞分別用胰酶消化后，低速離心棄上清液，在4 ℃環境下每管加入預冷的80%乙醇固定細胞7 h，低速離心洗滌棄上清液，分別將200 μl binding buffer、5 μl PI和5 μl RNase加入，吹打均勻后常溫避光靜置30 min后上流式細胞儀進行分析。

2 結果

2.1 SETDB1在DOX誘導的結腸癌細胞衰老模型中表達于HT29細胞中加入DOX 0.25 μmol/L誘導2 d，細胞衰老現象明顯增加，以此確認SETDB1是否參與了結腸癌細胞衰老(圖1A)。誘導組細胞增殖活性呈顯著降低趨勢(t=10.242,P<0.001，圖1B)。同時誘導組細胞發生了G2/M期阻滯，證明DOX誘導結腸癌細胞的衰老模型構建成功(圖1C、D)。另收集細胞行Western blot檢測SETDB1的蛋白表達量，結果誘導組中SETDB1蛋白表達量較對照組明顯下降，提示結腸癌細胞衰老過程中或許有SETDB1蛋白參與(圖1E)。

圖1 SETDB1在DOX誘導的結腸癌衰老模型中的表達

2.2 SETDB1對結腸癌細胞增殖的影響SETDB1在SW480細胞系和HT29細胞系均有表達，但表達差異有統計學意義(圖2A)。利用慢病毒轉染技術分別建立穩定低表達SETDB1的SW480細胞系和高表達HT29細胞系，并經Western blot檢測證實(圖2B、C)。在96 孔板中接種不同組細胞，CCK8 法檢測不同組細胞在0、24、48和72 h時的增殖情況，結果發現低表達SETDB1抑制結腸癌細胞增殖(F=25.527,P<0.001，圖2D)，而高表達SETDB1可促進結腸癌細胞的增殖(t=-6.328,P<0.01，圖2E)。

圖2 SETDB1對結腸癌細胞增殖情況的影響

2.3 SETDB1對結腸癌細胞衰老的影響利用β-半乳糖苷酶染色法對用DOX誘導后的穩定低表達SETDB1的SW480細胞和穩定高表達SETDB1的HT29細胞進行染色，觀察不同組細胞中染色情況。結腸癌細胞的增殖能力在STEDB1低表達后下降，衰老細胞占比從(22.00±4.35)%增加至(54.00±5.56)%和(53.33±4.93)%(F=40.484,P<0.001，圖3A、B)；結腸癌細胞的增殖能力在過表達STEDB1后上升，衰老細胞比例從(43.33±6.11)%降低至(21.33±3.51)%(t=5.407,P<0.01，圖3C、D)。

圖3 SETDB1對結腸癌細胞衰老的影響

2.4 SETDB1可對p53/p21通路進行調控GEO數據庫分析發現SETDB1的表達與P53信號通路相關(圖4A)，由Western blot證實p53及p21的蛋白水平在低表達SETDB1組細胞明顯增高(圖4B)，反之，過表達SETDB1可抑制p53及p21的蛋白表達(圖4C)，提示改變SETDB1的表達可調節p53/p21 信號通路。進一步檢測Vector、SETDB1及SETDB1+p53組細胞衰老水平，過表達SETDB1后結腸癌細胞衰老比例從(52.33±5.51)%降至(21.67±5.03)%(t=7.119,P<0.01，圖4D)，經過p53 質粒轉染，衰老細胞的占比則再次升至(40.67±4.04)%(t=-5.098,P<0.01，圖4E)，由此證明過表達p53可以逆轉高表達SETDB1引起的細胞衰老減少,說明結腸癌的細胞衰老可能是由SETDB1影響p53/p21信號通路調控來影響腫瘤的增殖。

圖4 SETDB1通過p53/p21通路調控結腸癌細胞衰老

3 討論

近年來，組蛋白相關功能的研究逐漸被醫學界所重視。組蛋白甲基化由27種不同的甲基轉移酶共同完成，這些甲基轉移酶在特定的點起作用，發揮不同的生物學功能。當甲基轉移酶SETDB1進入細胞質發揮非組蛋白的功能，可修飾p53細胞衰老[9-11]。目前參與細胞衰老調控的信號通路主要有p53/p21通路、Wnt/β-catenin通路，其中 p53/p21通路最為重要[12-13]。研究[14]表明，SETDB1是參與p53穩定性調節的重要調節器之一。為確定SETDB1是否會直接影響p53，利用GEO數據測序分析富集后呈現結果為低表達SETDB1時p53表達上調。

結腸癌是致人死亡的主要疾病之一。如何抑制結腸癌生長和轉移的方式既是臨床工作重點，也是基礎科研的主攻方向。SETDB1或許在結腸癌中起了癌基因的作用，但其作用機制未完全闡明，需要進一步的研究來探索其分子機制。課題組在前期研究[8]中所建立的細胞衰老模型中發現，升高或降低SETDB1的表達量可以影響細胞衰老。近來臨床研究[15]證實，細胞衰老在抗腫瘤和促進腫瘤發生特性的調節中SETDB1起到核心作用。有研究發現[12]，SETDB1在非小細胞肺癌患者中反復擴增和高表達。靶向SETDB1的抑制劑可能使過表達SETDB1的非小細胞肺癌患者受益。本研究發現，在腫瘤細胞衰老的過程中，SETDB1蛋白表達水平明顯下降，提示腫瘤衰老的過程有SETDB1參與。并且進一步通過慢病毒轉染穩定低表達RNA構建了低表達SETDB1的結腸癌細胞模型以此來闡明SETDB1可否調節結腸腫瘤的衰老。通過β-半乳糖苷酶染色提示SETDB1低表達確實可促進結腸癌細胞的衰老，其低表達可抑制結腸癌細胞增殖由CCK8實驗來進一步揭示。以上證據證明，SETDB1通過p53/p21通路影響結腸癌細胞衰老進而影響腫瘤細胞的生長方式，對腫瘤起到調控作用。綜上所述，本研究為SETDB1通過激活 p53/p21通路參與結腸癌細胞衰老過程提供了依據。