下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1通過(guò)靶向miR-211-5p對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的影響

曾友玲，張 清，曾 潔，王 歡，侯 俐

卵巢癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)腫瘤之一，惡性程度較高[1-2]。卵巢癌的治療在近十幾年中得到較大的發(fā)展，然而多數(shù)患者的預(yù)后仍不能滿(mǎn)足臨床需求[3]。高度的增殖性和侵襲性是卵巢癌預(yù)后較差的重要原因之一[4]。探討卵巢癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子發(fā)生機(jī)制，是卵巢癌有效分子治療靶點(diǎn)研究的重要方向。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是細(xì)胞內(nèi)具有重要功能的單鏈RNA分子，其廣泛參與眾多疾病的進(jìn)展[5-6]。近年的研究[7-9]證實(shí)，卵巢癌組織中存在lncRNA的異常表達(dá)，其表達(dá)水平與卵巢癌的耐藥性、放療敏感性密切相關(guān)。lncRNA在卵巢癌中的功能引起了研究們的廣泛關(guān)注。lncRNA SPINT1-AS1是目前發(fā)現(xiàn)的在惡性腫瘤中高表達(dá)的lncRNA，沉默lncRNA SPINT1-AS1的表達(dá)具有抑制細(xì)胞惡性侵襲和生長(zhǎng)的作用[10-12]。該研究通過(guò)DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p可能互為靶向關(guān)系。miR-211-5p是一個(gè)在卵巢癌中表達(dá)下調(diào)的抑癌基因，恢復(fù)其表達(dá)可抑制卵巢癌的生長(zhǎng)和進(jìn)展[13]。該研究通過(guò)檢測(cè)卵巢癌組織和細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA SPINT1-AS1的表達(dá)，旨在探究下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖和侵襲的影響，驗(yàn)證lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與試劑 永生化卵巢上皮細(xì)胞IOSE80、卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。lncRNA SPINT1-AS1 siRNA(CAGGATCGAAGA-GGGCGCA)、mimics control、miR-211-5p mimics、siRNA control均由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)公司構(gòu)建。熒光素酶報(bào)告載體SPINT1-AS1野生型(WT)、SPINT1-AS1突變型(MUT)載體由上海劍鈍生物科技有限公司構(gòu)建。MTT試劑盒和Transwell小室購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。山羊抗兔一抗β-Tubulin、PCNA、CyclinD1、MMP2、MMP9均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(ab18207、ab29、ab16663、ab92536、ab76003)。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)方法 通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析卵巢癌組織和正常組織中l(wèi)ncRNA SPINT1-AS1的表達(dá)差異。通過(guò)DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)lncRNA SPINT1-AS1的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 將OC3細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，將SKOV-3、A2780、HO-8910、IOSE80細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞接種到12孔板，根據(jù)Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)將lncRNA SPINT1-AS1 siRNA或siRNA control分別轉(zhuǎn)染至SKOV-3細(xì)胞中，命名為si-SPINT1-AS1組和si-NC組。轉(zhuǎn)染48 h后，測(cè)定各組SKOV-3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SPINT1-AS1表達(dá)變化。

1.2.3熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescence real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)測(cè)定lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p表達(dá) 提取永生化卵巢上皮細(xì)胞IOSE80、卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910)的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。配制qRT-PCR反應(yīng)體系，GAPDH作為lncRNA SPINT1-AS1表達(dá)量的參照，U6作為miR-211-5p表達(dá)量的參照。引物的序列如下，GAPDH F：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，R：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′；lncRNA SPINT1-AS1 F：5′-GCCCTGGAGGATGAGAG-3′，R：5′-CAGATGC-TGTTGGCTAAAGA-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAG-CACA-3′，R：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-211-5p F：5′-CTCGAGTAACCGTATTGTTCGCGTCATGCCAGCA-3′，R：5′-GCGGCCGCCAGACCATGTGTCCCATTTG-3′。利用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4MTT方法檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞的增殖活性 將SKOV-3細(xì)胞按照si-SPINT1-AS1組(轉(zhuǎn)染lncRNA SPINT1-AS1 siRNA)和si-NC組(轉(zhuǎn)染siRNA control)的分組方法接種于96孔板，每孔3 000個(gè)細(xì)胞。于第1、2、3、4、5 天，每孔加25 μl的MTT試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)結(jié)合3 h。每孔加125 μl的二甲基亞砜試劑，震蕩30 min，酶標(biāo)儀測(cè)定每孔SKOV-3細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)的吸光度(A)值，代表各組SKOV-3細(xì)胞的增殖活性。

1.2.5Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞的侵襲能力 用無(wú)血清的培養(yǎng)基以1 ∶7稀釋基質(zhì)膠，包被Transwell小室。用無(wú)血清的培養(yǎng)基重懸si-SPINT1-AS1組和si-NC組SKOV-3細(xì)胞，在Transwell底部加含10%血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育24 h。棉簽擦出濾膜上層的細(xì)胞，用多聚甲醛固定35 min，在結(jié)晶紫中染色40 min。倒置顯微鏡下(100倍視野)觀(guān)察細(xì)胞，取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)分析每組侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析lncRNA SPINT1-AS1對(duì)miR-211-5p的靶向作用 DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。把熒光素酶報(bào)告載體野生型WT以及突變型MUT分別和mimics control、miR-211-5p mimics共轉(zhuǎn)染至SKOV-3細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)48 h，參照雙熒光素酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組SKOV-3細(xì)胞中熒光素酶的活性。

1.2.7Western blot檢測(cè)PCNA、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá) 提取si-SPINT1-AS1組和si-NC組SKOV-3細(xì)胞總蛋白，電泳儀電壓為120 V，電泳100 min。轉(zhuǎn)膜電壓為110 V，轉(zhuǎn)膜110 min。將硝酸纖維素膜在6%的牛血清白蛋白中封閉，保證非特異性結(jié)合位點(diǎn)全部封閉。將硝酸纖維素膜在含有β-Tubulin、PCNA、CyclinD1、MMP2、MMP9抗體稀釋液(均按1 ∶1 000稀釋)的玻璃皿中結(jié)合13 h。將硝酸纖維素膜在含有二抗稀釋液的玻璃皿中結(jié)合3 h。滴加化學(xué)發(fā)光液，顯色和拍照，將β-Tubulin作為參照蛋白。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌組織中的表達(dá)lncRNA SPINT1-AS1由250個(gè)核苷酸組成，其結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示(圖2)，lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織(P<0.01)。

圖1 lncRNA SPINT1-AS1的結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌組織和正常組織中的表達(dá)

2.2 lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示(圖3)，與永生化卵巢上皮IOSE80細(xì)胞比較，卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910)中l(wèi)ncRNA SPINT1-AS1的表達(dá)水平升高(P<0.05)，SKOV-3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SPINT1-AS1的表達(dá)水平最高(F=20.46，P<0.01)。

圖3 lncRNA SPINT1-AS1在永生化卵巢上皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 兩組SKOV-3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SPINT1-AS1的下調(diào)效率qRT-PCR結(jié)果顯示，lncRNA SPINT1-AS1在si-SPINT1-AS1組和si-NC組的SKOV-3細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量分別為(1.06 ± 0.36)和(6.38 ± 0.77)，si-SPINT1-AS1可有效下調(diào)SKOV-3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SPINT1-AS1的表達(dá)(t=6.24，P<0.01)。

2.4 下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1表達(dá)對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖活性的影響MTT法檢測(cè)顯示(圖4)，與si-NC組比較，si-SPINT1-AS1組SKOV-3細(xì)胞接種2 d后，吸光度降低(P<0.05)，下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1抑制了SKOV-3細(xì)胞的增殖活性。

圖4 下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1表達(dá)對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖活性的影響

2.5 下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1表達(dá)對(duì)SKOV-3細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示(圖5)，si-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)(113.90 ± 11.96)個(gè)/視野明顯多于si-SPINT1-AS1組侵襲細(xì)胞數(shù)(44.27 ± 10.95)個(gè)/視野(t=4.30，P<0.01)，下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1抑制了SKOV-3細(xì)胞的侵襲能力。

圖5 下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1對(duì)SKOV-3細(xì)胞侵襲能力的影響

2.6 lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p互為靶向關(guān)系DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)lncRNA SPINT1-AS1的靶向基因結(jié)果顯示(圖6)，miR-211-5p和lncRNA SPINT1-AS1存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定顯示(圖7)，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T與miR-211-5p mimics后熒光素酶活性較WT與mimics control明顯降低(t=6.36，P<0.01)，定點(diǎn)突變后，共轉(zhuǎn)染MUT與miR-211-5p mimics較MUT與mimics control熒光素酶活性無(wú)明顯差異(t=0.40，P=0.71)，表明lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p互為靶向關(guān)系。

圖6 lncRNA SPINT1-AS1互補(bǔ)結(jié)合miR-211-5p的序列區(qū)域

圖7 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p互為靶向關(guān)系

2.7 下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1對(duì)SKOV-3細(xì)胞中miR-211-5p表達(dá)的情況qRT-PCR結(jié)果顯示，si-NC組SKOV-3細(xì)胞中miR-211-5p相對(duì)表達(dá)量(1.03 ± 0.43)明顯低于si-SPINT1-AS1組相對(duì)表達(dá)量(5.33 ± 0.69)，下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1能夠增加miR-211-5p的表達(dá)(t=5.27，P<0.01)。

2.8 下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1的SKOV-3細(xì)胞中PCNA、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖8)，下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1后，增殖表型蛋白PCNA、CyclinD1表達(dá)水平降低，轉(zhuǎn)移表型蛋白MMP2、MMP9表達(dá)水平降低。

3 討論

lncRNA是一種在人體細(xì)胞中發(fā)揮廣泛調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源性RNA，與消化系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)[14-16]。lncRNA與卵巢癌的發(fā)病有關(guān)，TTN-AS1[17]等lncRNA能夠有效減少卵巢癌細(xì)胞的數(shù)量，阻礙卵巢癌的進(jìn)展。MCM3AP-AS1[18]、LINC00176[19]等lncRNA能夠延緩卵巢癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞抵御化療藥物的殺傷作用。lncRNA SPINT1-AS1是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的lncRNA。Zhou et al[10]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SPINT1-AS1在乳腺癌患者血清和乳腺癌細(xì)胞系中上調(diào)，lncRNA SPINT1-AS1敲低后乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力降低，其可能通過(guò)結(jié)合let-7促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。Li et al[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SPINT1-AS1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，其與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和較短的無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間相關(guān)，lncRNA SPINT1-AS1是結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，同時(shí)在手術(shù)切除后的lncRNA SPINT1-AS1患者血清外泌體中觀(guān)察到lncRNA SPINT1-AS1表達(dá)水平降低。lncRNA SPINT1-AS1是一種腫瘤促進(jìn)因子。

本研究結(jié)果顯示，lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織，在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平高于正常卵巢上皮細(xì)胞，表明lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌中可能發(fā)揮促癌功能，與上述的研究報(bào)道一致。本研究在SKOV-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-SPINT1-AS1下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1后SKOV-3細(xì)胞增殖活性和侵襲能力降低，同時(shí)SKOV-3細(xì)胞增殖表型蛋白PCNA、CyclinD1表達(dá)水平降低，SKOV-3細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型蛋白MMP2、MMP9表達(dá)水平降低，提示下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1具有改善卵巢癌惡性增殖和侵襲的作用。

lncRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的方式是通過(guò)與微小RNA(miRNA)以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式進(jìn)行結(jié)合，特異性下調(diào)miRNA的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的各方面功能[5]。例如，SDHAP1通過(guò)與miR-4465相互作用影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的抗性[7]。本研究通過(guò)DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p可能互為靶向關(guān)系，具有互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域。miR-211-5p在乳頭狀甲狀腺癌、膀胱癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等很多惡性腫瘤中低表達(dá)，是一種腫瘤抑制因子[20]。miR-211-5p在卵巢癌中低表達(dá)，上調(diào)miR-211-5p能夠抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞轉(zhuǎn)移，促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥[13]。本研究結(jié)果表明，lncRNA SPINT1-AS1能夠靶向結(jié)合miR-211-5p，且下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1能夠促進(jìn)miR-211-5p的表達(dá)，表明lncRNA SPINT1-AS1作用機(jī)制與miR-211-5p有關(guān)。

綜上所述，lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，下調(diào)lncRNA SPINT1-AS1可抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力，其機(jī)制與靶向促進(jìn)miR-211-5p表達(dá)有關(guān)。本研究為lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌靶向治療的應(yīng)用研究提供了參考。