羊毛固醇合成酶雜合敲除小鼠全腦轉錄組學分析

李艷玲，李昱昊，孫曉梅，張 軍，張素梅，張勝權

膽固醇是哺乳動物細胞中重要的脂質分子，可以調節生物膜的流動性[1]。膽固醇在體內可以轉化成類固醇激素、膽汁酸和氧化固醇調控機體的生長發育等生理過程。膽固醇代謝異常參與了動脈粥樣硬化、癌癥、阿爾茨海默病和其他神經退行性疾病的發生發展。羊毛固醇合成酶(lanosterol synthase，LSS)催化(S)-2，3-氧化喹烯環化合成羊甾醇形成甾醇核的反應[2]。Mori et al[3]證實LSS基因的錯義突變可導致先天性白內障。羊毛固醇轉化為膽固醇有兩種途徑：Bloch途徑和Kandutsch Russell途徑。在小鼠中，Bloch途徑介導了睪丸、脾臟和腎上腺中90%或更多的膽固醇生物合成，而大腦70%以上的膽固醇生物合成來自腦星型膠質細胞[4]。該研究通過LSS(+/-)小鼠與野生型(wide type，WT)小鼠全腦基因表達譜分析，經過數據篩選和基因表達譜的聚類分析，找出差異表達基因，為進一步研究膽固醇代謝對動物行為學的影響及在神經系統疾病中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物委托南京生物醫藥研究所構建LSS(+/-)小鼠，回交繁殖，取8周齡LSS(+/-)雌鼠及WT雌鼠全腦組織委托華大基因公司進行RNA-Seq分析(n=3)，同時取全腦組織進行實時定量熒光PCR及Western blot分析。動物實驗方案符合安徽醫科大學動物倫理委員會相關規定。

1.2 試劑裂解液 RIPA、SDS-PAGE(5×)、Trizol、蛋白預染 Mark 購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Tris、甘氨酸、SDS 購自上海生物工程有限公司；Tween-20 購自美國Sigma公司；抗體稀釋液購自美國TOYOBO 公司；10×Loading Buffer、 DL2000 DNA Ladder 購自美國TAKARA 公司；蛋白胨、瓊脂粉、蛋白胨購自美國OXOID公司；EB購自賽百盛基因技術有限公司；鼠尾基因鑒定試劑盒購自上海碧云天生物有限公司。

1.3 小鼠基因組DNA提取剪取小鼠尾尖3～5 mm放入1.5 ml EP管中，實驗試劑按照比例將DNA Extraction Solution 和 Enzyme Mix 充分混勻，取0.5 ml消化液加入EP管中，55 ℃，3～5 h。15 000 r/min離心，10 min。取上清液0.4 ml，加入異丙醇，上下顛倒10次，4 ℃，15 000 r/min離心，5 min。去上清，濾紙吸干，加入70%乙醇溶液，將管底沉淀彈起，洗滌。離心，去上清液，空氣干燥5～10 min，加入1×TE約100 μl，震蕩30 min，于4 ℃保存。具體方法按試劑盒說明書操作。

1.4 PCR擴增反應PCR是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在有引物存在的情況下，進行互補鏈的延伸，反復的循環能使模板DNA得到極大的擴增。于離心管中，加入Premix Taq(TaKaRaTaq Version 2.0 Plus dye) 15 μl、R引物1 μl孔 DNA模板1 μl、F 引物1 μl、加入雙蒸水補足至30 μl。在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP為原料，引物沿5′→3′方向延伸，形成新的DNA片段，如此重復改變溫度，使目的基因得以迅速擴增。引物是由南京大學南京生物醫藥研究所設計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，LSS基因引物分別是ACCTGGGCGGAGTCTAAGGAAG(上游)和AAGGCTCTCCACTGTTTCAGAGCT(下游)。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳和基因型結果判斷取0.24 g瓊脂糖加入25 ml 1×TAE電泳緩沖液中，加熱至完全溶解，稍冷卻至不燙手，加入2 μl EB，上樣DNA樣本5 μl，電泳電壓90 V，時間90 min，于化學發光凝膠成像系統中拍照觀察。擴增產物長度為328 bp左右條帶為WT小鼠；擴增產物有282 bp和328 bp兩條電泳條帶則為雜合敲除小鼠LSS(+/-)。

1.6 RNA-Seq分析取8周齡LSS敲除(+/-)小鼠與WT C57BL/6雌鼠各3只，水合氯醛麻醉處死，取全腦，提取總RNA，委托華大基因公司進行RNA-Seq分析。

1.7 實時定量熒光PCR分析取小鼠尾部組織，提取和反轉錄RNA，PCR擴增。配置PCR反應液，冰上操作。考慮到加樣誤差，PCR反應液應比實際需要多配置一些體積。將配完的反應液分裝至反應板或微量離心管中。蓋上管蓋，確保封嚴。為避免干擾PCR儀讀取熒光信號，應謹慎選擇在反應板或離心管上標記的位置，使用離心機高速瞬離。將反應板放入實時定量熒光 PCR擴增儀中。根據說明書設定反應程序。反應結束后確認擴增曲線和融解曲線。導出、拷貝數據，計算、統計結果。結果以2-ΔΔCt方法計算。

1.8 Western blot 檢測腦組織中LSS蛋白的表達取全腦組織置于離心管中，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿機破碎組織，提取全腦組織總蛋白。用蛋白濃度測定試劑(BCA法)進行蛋白定量，取蛋白樣品加入上樣緩沖液，煮沸。保存于-20 ℃冰箱。配置10%聚丙烯酰胺凝膠，蛋白樣品上樣，電泳1 h后轉膜，轉膜后牛奶封閉，一抗(1 ∶1 000) 4 ℃過夜,次日用1×TBS-T 洗膜3次,加二抗室溫2 h,1×TBS-T洗膜3次。 ECL 化學發光試劑進行顯影,軟件測定吸光度值以計算蛋白表達。

1.9 基因表達譜分析技術以biotinylated oligo(dT)為引物反轉錄合成cDNA，用限制性內切酶酶切。通過鏈霉抗生物素蛋白珠收集cDNA 3′端部分。對每一個mRNA只收集其polyA尾與最近的酶切位點之間的片段。將cDNA等分為A和B兩部分，分別連接接頭A或接頭B。接頭的結構為引物A/B序列+標簽酶識別位點+錨定酶識別位點。用標簽酶酶切產生連有接頭的短cDNA片段(約9～10堿基)，混合并連接兩個cDNA池的短cDNA片段，構成雙標簽后，用引物A和B擴增。

2 結果

2.1 C57BL/6小鼠基因型鑒定LSS敲除(+/-)小鼠回交繁殖的子代8周齡雌鼠，剪尾提取基因組DNA、PCR及瓊脂糖電泳分析結果見圖1。LSS敲除(+/-)小鼠的PCR擴增產物為兩條帶，大小分別為282 bp和328 bp，而WT小鼠僅一條帶為328 bp。圖1中3、4、7、10號為LSS(+/-)小鼠，而2、6、8及11～18號為WT小鼠；1、5、9號小鼠需重新鑒定。

圖1 小鼠基因型鑒定PCR擴增產物瓊脂糖電泳結果

2.2 RNA-Seq分析結果選取8周齡LSS敲除(+/-)小鼠及C57BL/6小鼠各3只，取全腦提取總RNA進行RNA-Seq分析。結果發現兩組間存在320個差異基因(P<0.05)，見圖2，其中上調基因 145個，下調175個。使用 R 軟件中的 phyper 函數進行富集分析，計算 P值，然后對P值進行 FDR 校正得到Q值，Q≤0.05的功能視為顯著富集。KEGG 通路富集及網絡互作分析發現，差異基因表達與神經活化的受體與配體通路(16個基因)、河馬信號途經(7個基因)及谷氨酸能突觸途徑(9個基因)有關，見圖3、4。

圖2 LSS敲除(+/-)小鼠及C57BL/6小鼠差異表達基因熱圖

圖3 差異基因KEGG富集結果

2.3 實時定量熒光PCR技術分析LSS(+/-)及WT小鼠全腦RNA-Seq為了進一步驗證RNA-Seq分析的結果，本實驗通過實時定量熒光PCR技不同形狀表示不同的內容(節點，node)，方塊表示KEGG Pathway，圓形表示mRNA；顏色和大小都表示與該節點連接的基因或轉錄本數；顏色越深、方塊越大，表示與該節點連接的基因或轉錄本越多術分析LSS(+/-)小鼠及WT C57BL/6小鼠全腦mRNA，結果提示，與WT小鼠比較，LSS(+/-)小鼠中CCKBR與Htr5b的表達分別上調約8倍及6倍， 而Gri2c、Drd2、Grm4及Adora2d表達均下調，這些基因中大部分與情緒相關，提示其可能影響小鼠的情緒，見圖5。

圖4 差異表達基因網絡互作圖

圖5 實時熒光定量PCR分析結果

2.4 CCKBR基因在LSS(+/-)小鼠腦中高表達選取8周齡WT C57BL/6小鼠及LSS敲除(+/-)小鼠各3只，分別提取小鼠全腦組織總蛋白，CCKBR基因在LSS(+/-)小鼠中明顯高表達，見圖6。總ERK無變化，p-ERK在LSS(+/-)組表達較高，總AKT在LSS(+/-)組表達較低。

圖6 小鼠全腦組織Western blot分析結果

3 討論

膽固醇代謝對大腦功能影響十分重要，膽固醇合成的LSS，其催化環氧鯊烯環化成第1個固醇類化合物——羊毛固醇，因此，LSS是膽固醇合成過程中的關鍵酶之一[5]。通過RNA-Seq分析LSS敲除(+/-)小鼠及WT C57BL/6小鼠差異表達基因提示：LSS雜合敲除，導致了小鼠大腦中320個基因表達發生改變，其中上調基因 145個，下調175個，這些差異基因涉及了神經活化的受體與配體通路、河馬信號通路及谷氨酸能突觸相關通路，提示LSS雜合敲除可能影響小鼠大腦功能及行為。

膽固醇對腦功能的影響至今在動物模型及人類臨床研究中沒有取得一致的結果，有研究[6]提示高膽固醇飲食損害動物及人的學習記憶能力，而有研究[7]卻取得了相反的結果。由于血腦屏障的關系，血液中的膽固醇并不能進入大腦，大腦中的膽固醇主要由腦星型膠質細胞合成[8-9]。本研究建立的LSS雜合敲除小鼠模型，理論上會導致大腦膽固醇合成的減少，有助于探討膽固醇對大腦功能的影響，但LSS雜合敲除理論上還導致了羊毛固醇及其下游產物的減少，而這些中間產物對大腦的功能也有一定影響，因此，LSS雜合敲除對腦功能的影響可能不僅僅能用膽固醇的減少來解釋，這是本模型在研究膽固醇對大腦功能影響的不足之處。 研究[10-11]表明人類LSS基因突變導致白內障、少毛癥等疾病，通常伴有智力障礙，提示LSS基因突變影響大腦功能。本研究發現LSS雜合敲除導致了大腦中320個表達差異基因，這些基因與大腦的神經信號通路有關。熒光定量PCR驗證發現與情緒有關基因表達顯著升高。其中CCKBR表達顯著上調，該受體活化參與調節多種神經生物學過程，包括：焦慮、痛覺、突觸傳遞等活動[12]，同時全腦中AKT與ERK活化成相反趨勢，研究表明ERK 活化促進神經元的分化，而AKT活化誘導神經元祖細胞增長和存活，提示這兩條信號途徑對神經細胞生理功能均具有重要作用[13]，但CCKBR上調與AKT及ERK信號通路的關系等分子機制有待進一步研究。

本研究僅分析了LSS雜合敲除導致小鼠大腦差異表達基因及其通路分析，給出了LSS基因功能異常及膽固醇水平變化可能影響大腦功能的分子水平的初步證據，下一步需要重點探討其中一些重要的基因對小鼠行為學的影響，并闡明LSS雜合敲除及膽固醇水平變化對大腦功能影響的分子機制，為人類疾病如阿爾茨海默病等發病機制的研究提供幫助。