Nod2基因在肺炎克雷伯菌肝膿腫中的作用研究

孟 寶，伍 婷，蘇 叢，孫雅婷，唐明洋，郭明娟，蘭燕虎，李家斌,,5

化膿性肝膿腫是肝臟的占位性病變，具有高的致病率和致死率，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae)是其主要的致病菌之一[1-2]。核苷酸結合寡聚化結構域2(nucleotide binding oligomerization domain 2，NOD2)是核苷酸結合寡聚化結構域樣受體 (nucleotide binding oligomerization domain-like receptor，NLR) 家族的成員，參與激活NF-κB、MAPKs等促炎通路，增強炎癥反應，調節機體免疫應答[3]。近期研究[3-7]表明，NOD2在肺組織防御病原菌感染過程中發揮重要保護作用。目前關于NOD2在肝組織防御病原菌感染過程的作用機制尚不明確。該研究通過繁育和鑒定Nod2基因肝組織條件性敲除小鼠[8]，建立Nod2基因肝臟敲除小鼠感染K.pneumoniae誘發肝膿腫模型，初步探究Nod2基因在K.pneumoniae誘導肝膿腫發生發展中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物與菌株Nod2flox/+小鼠共 3 只，雌鼠 1 只、雄鼠 2 只；Alb-Cre+工具鼠共 2 只，雌、雄各 1 只均購自賽業(廣州)生物科技有限公司，20～30 g/6周齡，小鼠品系為C57BL/6J，無特殊病原體(SPF級)。K.pneumoniaeATCC13883由安徽省細菌耐藥監測中心保存。所有實驗操作均遵循安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的批準，倫理審批號：LLSC20190253。

1.1.2主要試劑與儀器 主要試劑：鼠尾基因組DNA 提取試劑盒(貨號：NMSC0001-50)購自上海南方模式生物科技股份有限公司；瓊脂糖粉(批號：111860)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Trizol Reagent(貨號：15596026)購自美國Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑盒(貨號：6210A)、DL2000 bp DNA Marker(貨號：A1A0438)、TB Green Premix Ex TaqTM(貨號：RR420)以及PCR Taq Mix(貨號：RR901)均購自日本Takara公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：P0010S)購自碧云天生物技術有限公司；小鼠抗β-Actin 抗體(貨號：AF7018)購自江蘇親科生物研究中心有限公司；兔抗NOD2抗體(貨號：abs152480)購自愛必信(上海)生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG-HRP(貨號：ZB-2305)、山羊抗兔IgG-HRP(貨號：ZB-2301)購自北京中杉金橋公司。

主要儀器：普通PCR擴增儀(德國Biometra Tone公司)，核酸電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；凝膠電泳成像儀(Tanon 5200 Multi，上海天能科技有限公司)，熒光定量PCR儀(羅氏LightCycler 96，瑞士)，Western blot 電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠的飼養與繁育Nod2基因條件敲除小鼠于安徽醫科大學實驗動物中心SPF級動物房內飼養與繁殖。飼養室溫控制在20～25 ℃，濕度50%～60%，保證12 h光照，晝夜交替,自由飲食和飲水。小鼠籠盒、墊料、飼料和飲用水經過高溫高壓消毒滅菌處理。每周更換2次墊料，更換水和飼料，并且給予人道關懷。

1.2.2小鼠親代及子代信息記錄 在繁殖籠標簽上，記錄鼠號、基因型、出生日期、合籠日期、父母本的鼠號、產仔日期和數量。在離乳籠標簽上，記錄籠號、基因型、出生日期、離乳日期。

1.2.3小鼠基因型鑒定 小鼠出生后3～4周與母鼠分籠，使用75%乙醇溶液沖洗剪刀和鑷子并剪取小鼠腳趾0.3～0.5 cm放入1.5 ml 無菌EP管中，并依據剪取的不同腳趾標記同窩小鼠。用基因組DNA提取試劑盒提取小鼠基因組DNA，所得樣品置-20 ℃保存。Nod2flox/+小鼠基因型鑒定，上游引物：5′-CATCGCAGCCAGACTTGAAGTT-3′；下游引物：5′-CCTTGTTGCCCATATGATTCTGAC-3′(flox純合子小鼠：216 bp；flox雜合子小鼠：216 bp和171 bp；flox陰性小鼠：171 bp)。Alb-Cre+小鼠基因型鑒定，上游引物：5′-GAAGCAGAAGCTTAGGAAGATGG-3′；下游引物：5′-TGCAAACATCACATGCACAC-3(Alb-Cre+小鼠：390 bp；Alb-Cre-小鼠：351 bp)。PCR反應體系為25 μl(Taq Mix 13 μl，去離子水10 μl，引物1 μl，小鼠DNA 1 μl)，反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35 個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃ 1 h。

配制2.0%的瓊脂糖凝膠：稱取2.0 g瓊脂糖粉末溶于100 ml 1×TAE電泳緩沖液中，微波爐中高火加熱4 min，冷卻至60 ℃左右加入10 μl 紅色熒光核酸染料，輕搖混勻，制膠。取5 μl PCR產物和3 μl DL2000 bp DNA Marker加入上樣孔中進行電泳分析，恒壓150 V，時間35 min；然后置于凝膠電泳成像儀中成像，觀察電泳條帶。

1.2.4Nod2基因敲除效果驗證 取Nod2flox/flox;Alb-Cre+(實驗組小鼠)和Nod2flox/flox(對照組小鼠)的肝組織，采用RT-qPCR方法檢測兩組肝組織Nod2基因的mRNA 的表達水平。上游引物：5′-AGAAGCTCCTCGAAGCTGTG-3′；下游引物：5′-CCTCACACTCGTACTGGCTC-3′；內參Gapdh基因上游引物為5′-GTCAAGGCCGAGAATGGGAA-3′；下游引物為5′-CTCGTGGTTCACACCCATCA-3′。Western blot檢測兩組肝組織NOD2 蛋白的表達水平：用 RIPA裂解液提取兩組小鼠的肝組織總蛋白，BCA蛋白定量后取適量與上樣緩沖液混合100 ℃水浴10 min變性。將所制蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，恒壓75 V，120 min；電泳結束后將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入經一抗稀釋液稀釋的β-Actin抗體(1 ∶1 000)、NOD2抗體(1 ∶800)，4 ℃孵育過夜；1×TBST緩沖液洗膜3 次，每次10 min；加入5%脫脂奶粉稀釋的山羊抗兔或山羊抗鼠的二抗(1 ∶10 000)孵育 1.5 h，1×TBST緩沖液洗脫3 次后化學發光成像系統進行拍照，觀察NOD2蛋白表達情況，進一步驗證Nod2基因在肝組織中的敲除效果。

1.2.5小鼠感染K.pneumoniae誘發肝膿腫模型 將K.pneumoniaeATCC13883劃線接種在MHA固體培養平板上，37 ℃過夜培養；次日，挑取單菌落于液體MHB培養基中，制備成1.5×108CFU/ml的細菌懸浮液；每只小鼠口腔灌胃0.3×108CFU肺炎克雷伯菌(體積為200 μl)誘發肝膿腫。

1.2.6小鼠肝組織病理切片制備 使用1%戊巴比妥納腹腔麻醉小鼠取出完整肝組織，放入10%的中性福爾馬林中固定；將固定好的小鼠肝臟組織依次進行脫水透明、浸蠟包埋、切片展片、脫蠟染色，最后用中性樹膠封片，存放備用。

1.2.7小鼠肝組織炎癥因子熒光定量PCR檢測Nod2flox/flox;Alb-Cre+(實驗組小鼠)和Nod2flox/flox(對照組小鼠)分別感染K.pneumoniae48 h后，取出肝組織，采用RT-qPCR方法檢測兩組小鼠肝臟中炎癥因子腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)和趨化因子CXC配體1(C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1) 的mRNA表達量。GAPDH上下游引物見“1.2.4”；TNF-α上游引物為5′-TGACAAGCCTGTAGCCCACG-3′，下游引物為5′-TTGTCTTTGAGAT- CCATGCCG-3′。IL-1β上游引物為5′-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3′，下游引物為5′-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3′；CXCL1上游引物為5′-ACAGGGGCGCCTATCGC-3′，下游引物為5′-ACAATTTTCTGAACCAAGGGAGC-3′。

1.3 統計學處理采用SPSS 16.0 軟件進行統計學分析，每組實驗重復3次，組間比較采用t檢驗，對于生存率曲線比較，使用Log-Rank(Mantel-Cox) 檢驗分析結果。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠基因型鑒定結果取幼鼠腳趾進行小鼠基因型鑒定?；蛐丸b定PCR結果如圖1所示，1、2、5為flox純合子(Nod2flox/flox，216bp)；3和4 為flox雜合子(Nod2flox/+，171 bp和216 bp)。Alb-Cre基因型鑒定PCR結果如圖2 所示：其中1、3和4為Alb-Cre+小鼠 (390 bp)，2和5為Alb-Cre-小鼠(351 bp)。選擇1為實驗組小鼠(基因型：Nod2flox/flox;Alb-Cre+)，2、5為對照組小鼠(基因型為Nod2flox/flox)。

圖1 flox基因型鑒定結果

圖2 Cre基因型鑒定結果

2.2 條件性基因敲除小鼠敲除效果驗證取5只實驗組和5只對照組小鼠肝臟進行敲除效果驗證。提取小鼠肝組織RNA，反轉錄為cDNA后進行熒光定量PCR鑒定。結果如圖3所示，Nod2flox/flox;Alb-Cre+小鼠肝臟NOD2 mRNA的表達量小于Nod2flox/flox小鼠肝臟NOD2 mRNA 的表達量[(0.419±0.097)vs(1.030±0.320)，P<0.05]。Western blot實驗結果如圖4所示，與Nod2flox/flox小鼠比較，Nod2flox/flox;Alb-Cre+小鼠NOD2蛋白降低。最終獲得了可以用于后續實驗的Nod2基因肝臟條件性敲除小鼠(Nod2flox/flox;Alb-Cre+)。

圖3 兩組小鼠NOD2 mRNA表達量

圖4 兩組小鼠NOD2蛋白表達水平

2.3Nod2flox/flox;Alb-Cre+小鼠感染肺炎克雷伯菌后表型變化為探究Nod2基因在小鼠肝臟感染K.pneumoniae中發揮的作用，實驗組小鼠(基因型：Nod2flox/flox;Alb-Cre+)和對照組小鼠(基因型：Nod2flox/flox)各取10只，通過口腔灌胃的方法制備肝膿腫模型，檢測小鼠和肝組織病理變化和72 h死亡率。結果發現，實驗組小鼠和對照組小鼠感染K.pneumoniae48 h后，與對照組比較，實驗組肝組織整體結構大面積受到破損，病理損傷程度嚴重(圖5)；對照組小鼠72 h死亡率為30%，實驗組小鼠組72 h死亡率為70%(中位生存時間60.5 h，P=0.046 9)，差異有統計學意義(圖6)。

圖5 兩組小鼠肝組織病理學改變 HE×200

圖6 兩組小鼠感染肺炎克雷伯菌后生存率曲線

2.4Nod2flox/flox;Alb-Cre+小鼠感染K.pneumoniae后肝臟炎癥因子表達水平改變比較實驗組小鼠(基因型：Nod2flox/flox;Alb-Cre+)和對照組小鼠(基因型為Nod2flox/flox)感染K.pneumoniae48 h后肝組織炎癥因子的表達水平。結果如圖7所示，與對照組比較，實驗組小鼠肝臟內的炎癥因子TNF-α(t=3.736，P=0.020)、IL-1β(t=3.114，P=0.036)和CXCL1(t=3.264，P=0.031)的相對表達量降低，差異有統計學意義。

圖7 兩組小鼠感染肺炎克雷伯菌后肝臟炎癥因子mRNA表達

3 討論

K.pneumoniae是一種革蘭染色陰性的條件致病菌，可引起多種感染性疾病，包括菌血癥、肺炎和肝膿腫等[9]。健康人體腸道內定值的高毒力K.pneumoniae，在病理狀態下可經門靜脈系統進入肝臟引起肝膿腫，伴有膿毒癥的K.pneumoniae肝膿腫還可以引起眼內炎、腦膜炎、壞死性筋膜炎等肝外并發癥[2,10-11]。胞質內模式識別受體NOD2可識別細菌產生的肽聚糖MDP，通過招募并與接頭蛋白RIP2或CARD9結合觸發NF-κB、MAPKs等促炎信號通路，產生炎癥因子和抗菌肽，在宿主抵御細菌感染的過程中發揮重要作用[12-14]。已有研究發現NOD2在肺炎鏈球菌感染的腦膜炎中通過誘導腦部炎癥和自噬發揮保護作用[15]；NOD2在早期鮑曼不動桿菌肺部感染中通過產生活性氧/活性氮參與肺防御[7]。目前，Nod2基因在肝臟中的功能尚不明確。

本研究利用Cre-Loxp重組酶系統敲除小鼠肝臟中Nod2基因，通過繁育和基因鑒定，成功篩選出純合子幼鼠(Nod2flox/flox;Alb-Cre+)；RT-qPCR和Western blot結果顯示，NOD2 mRNA表達量降低，NOD2蛋白表達量降低，這提示小鼠肝臟Nod2基因敲除成功。

K.pneumoniae感染肝組織后，肝臟Kupffer細胞、毛細血管內皮細胞、單核細胞及巨噬細胞可以通過產生IL-1β、TNFα、CXCL1等細胞因子，產生保護性的免疫應答。本研究發現，在感染K.pneumoniae的小鼠中，肝臟Nod2基因敲除后，小鼠生存率降低且肝組織病理損傷增大，說明條件基因敲除小鼠對K.pneumoniae感染的抵抗能力減弱。此外，感染K.pneumoniae的Nod2基因條件敲除小鼠肝臟炎癥因子TNF-α、IL-1β和CXCL1的mRNA相對表達量均降低，由此可見NOD2可能通過其介導的炎癥反應影響肝臟抗K.pneumoniae感染的免疫應答。