DNA脫堿基位點的檢測方法及其生物學研究進展

武海江，張雅姣，袁舒妍，徐 華*，謝劍煒

（1．軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；2．沈陽藥科大學 無涯創新學院，遼寧 沈陽 110016）

生理條件下，DNA會自發斷裂N-糖苷鍵脫去堿基（Apurinic/apyrimidinic，AP）形成AP位點損傷［1-7］（圖1A），據報道，平均每天每個哺乳細胞至少會產生10 000個內源性AP位點［2，8］。當DNA暴露于外源性物質如酸、烷化劑、電離離子或紫外線后［9-12］均會使DNA脫去堿基并生成AP位點［13］（圖1B）。另外AP位點也是堿基切除修復（Base excision repair，BER）途徑的關鍵中間體［14］，如活性氧引起DNA氧化損傷的標志物8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷（8-OHdG）經BER中特殊糖基化酶的切除而形成AP位點［13，15］（圖1C）。若AP位點未有效修復，可能會導致DNA聚合酶停滯和DNA鏈斷裂，產生突變和細胞毒性［1-2，13，16］，因此對AP的檢測有助于細胞損傷程度評估和化合物毒性評價［17-19］。近年來，由于交聯損傷的嚴重性，AP位點形成的DNA鏈間交聯（Interstrand crosslink，ICL）［20-27］和蛋白質交聯［28-32］（DNAprotein crosslink，DPC）亦引起人們的重點關注。本課題組在前期工作中建立了細胞、血液、尿液及臟器中DNA加合物的質譜定量方法，實現了各臟器中DNA損傷的定量評價［33-35］；構建了組蛋白H2AX和H3磷酸化生物標志物的穩定同位素稀釋液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）方法，實現對化合物基因毒性的快速發現和定量檢測，并初步證明了該方法具有體外評價化學品致癌性的應用潛力［36-37］。課題組近期還開展了脫堿基位點交聯加合物（AP-base）的高靈敏LC-MS/MS分析，在細胞中首次鑒定3種新型AP-base，對不同類型細胞中AP-base本底值進行了定量評價及相關毒物暴露研究［38］。

圖1 AP位點的形成機制：DNA自發脫堿基形成AP位點（A）；AP位點形成的潛在來源（B）；脫氧鳥苷（dG）與活性氧反應生成8-OHdG，隨后經DNA糖基化酶將8-OHdG切除后生成AP位點（C）Fig．1 Mechanisms of AP site formation：spontaneous base loss of DNA leads to the AP site formation（A），potential sources of base damage destabilizing the N-glyosidic bond and generating AP site（B），and deoxyguanosine（dG）reacted with reactive oxygen species to generate 8-OHdG，which is subsequently cleaved by DNA glycosylase to generate AP sites（C）R：DNA

AP位點的檢測方法主要有14C［39-40］或32P［41-42］后標記法、含醛基反應探針（Aldehyde-reactive probe，ARP）的酶聯免疫吸附分析法（ELISA-like）［43-46］、熒光法［17-18，47-49］和液相色譜-質譜法［50-54］等。其中，含ARP的ELISA-like方法是檢測和定量分析AP位點的重要方法，但其除標記AP位點的開鏈醛外［48，55-56］還會標記其它含醛基的化合物，可能會導致假陽性結果。近些年，質譜法以其高靈敏和高特異的技術優勢逐漸應用于AP位點的分析檢測［50，57-58］。

本文對AP位點的定性和定量分析方法進行了總結，對AP位點損傷在環境污染物及抗癌藥物的評價、細胞損傷和疾病相關的研究進展進行了評述。由于AP位點相關交聯（如ICL和DPC）存在潛在重要的生物學意義，本文亦重點對其進行了介紹。

1 脫堿基位點特點

每個細胞每天均可能產生成千上萬的AP位點，其作為一種常見的DNA損傷形式，能對細胞的功能、基因組穩定性和疾病產生較大影響，能有效阻斷聚合酶并影響其對基因組信息的讀取和復制，是致突變的潛在源頭之一［13］。

AP位點的結構以閉鏈縮醛形式（99%）和開鏈醛（1%）兩者的平衡形式存在（圖2）［4］。由于氫鍵及其他非共價相互作用的缺失，AP位點會使DNA雙鏈變得不穩定。AP位點自身親電且具有化學不穩定性，例如，DNA的AP位點在生理條件（pH 7．4，37℃）下的半衰期約為200 h［59］，在加熱處理或弱堿處理時會加速DNA鏈在AP位點的斷裂［60-62］，在酸性條件下也會通過脫嘌呤產生額外的AP位點。

圖2 AP位點在水溶液中的平衡態存在形式：閉鏈縮醛和開鏈醛［4］Fig．2 The equilibrating forms of AP site in aqueous solution：close-chain acetal and open-chain aldehyde［4］

除了產生鏈斷裂，由于AP位點的化學反應活性，AP位點的開鏈醛還會分別與蛋白質或DNA互補鏈上的堿基發生共價反應形成DPCs和ICLs，從而形成更嚴重的損傷類型［2，19］。目前，細胞有多種修復和耐受機制以應對DNA損傷，雙鏈DNA中的AP位點大多數通過BER途徑進行修復，核苷酸切除修復（NER）則作為備用途徑［14］。近期，對AP位點的修復和耐受途徑研究已有評述報道［13］。

2 脫堿基位點作為中間體形成的交聯

相比于其它DNA損傷如DNA加合物、堿基錯配和堿基損傷等類型，DNA鏈間交聯和DNA-蛋白質交聯的研究報道較少［28-29］。但由于DNA交聯以及DNA-蛋白質交聯可導致嚴重的基因毒性，近年來其研究越來越受到重視［28］，AP位點作為最常見的DNA損傷類型之一，與其相關的ICL和DPC交聯現象已成為研究重點［29，31］。

2.1 AP位點形成的DNA交聯

DNA鏈間交聯是最嚴重的DNA損傷類型之一，其形成會影響DNA的復制和轉錄［2］。由于AP位點存在兩種互變平衡結構（圖2），DNA中AP位點的開鏈醛可與互補鏈上的堿基發生共價加合形成ICL（圖3）。

圖3 由AP位點作為中間體形成ICL的形成機制及對應生成的交聯加合物Fig．3 The formation mechanisms of ICL derived from the AP site as intermediate and the corresponding crosslinked adducts

Dutta等［27］首次在無外源分子參與情況下清晰表征了DNA鏈間交聯情況，隨后運用質譜技術和凝膠電泳技術證明AP位點可分別與鳥嘌呤和腺嘌呤的環外氨基發生反應，形成AP-dG和AP-dA的ICL［20-21］（圖3A、3B），同時利用核磁共振技術表征了形成的ICL交聯加合物（圖3D）［63-64］。通過考察AP-dG和AP-dA交聯加合物的穩定性，發現這兩類交聯加合物在pH 7．0、37℃時相當穩定，意味著AP-dG ICL和AP-dA ICL可能是一種持久損傷，可能導致DNA的復制阻滯［63-64］。研究又通過可以耦合DNA合成和鏈置換的噬菌體φ29 DNA聚合酶作為模型系統測試了AP-dA交聯影響DNA加工酶的能力，證明AP位點形成的交聯能阻斷細胞中各種DNA加工酶的作用［65］。

最近，Hu等［66］利用高分辨質譜技術在小牛胸腺DNA（Calf thymus DNA，CT-DNA）酶解樣品中檢出了AP位點與胞嘧啶殘基反應形成的交聯加合物（AP-dC）［66-67］。Varela等［24］隨后也證明了AP位點的醛基可與互補鏈上已錯配胞嘧啶的環外氨基發生反應，形成AP-dC ICL（圖3C）。值得注意的是，研究表明，當胞嘧啶殘基與鳥嘌呤發生正常沃森-克里克配對時，這二者并不能形成交聯。

目前，AP-dG、AP-dA和AP-dC等3種ICLs的形成僅在溶液體系中被鑒定，但細胞中是否存在上述鏈間交聯及其結構特性如何仍屬未知［19，24］。對不同寡核苷酸序列的研究表明AP-dA、AP-dG形成交 聯的 產率 分別 為15%~85%［21］和2%~3%［20，27］，經NaCNBH3還原 后 的AP-dG交聯 產率 為20%左右［20，27］。考慮到細胞在正常生理條件下會產生至少10 000個AP位點［2，8］，研究者們推斷在細胞中可能會檢測到AP位點交聯加合物，但對檢測方法的靈敏度和實驗設計提出了更高要求［19，66］。Huskova等［22］通過體外實驗研究了AP-ICL的形成速率、產量和穩定性，揭示AP位點周圍富含腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對（AT）比富含鳥嘌呤-胞嘧啶堿基對（GC）的區域更易形成AP-ICL，并基于AP-ICL形成的生化實驗，推斷在人體細胞中存在或可形成1~5個ICLs。相比其它常見的DNA損傷類型，由AP位點作為中間體形成的DNA鏈間交聯是一種更為嚴重的DNA損傷，這種交聯在細胞中存在的可能性及其可能引起的生物學結局值得重點關注。

2.2 AP位點形成的蛋白質交聯

DNA-蛋白質交聯是蛋白質和DNA中1條鏈發生共價加合形成的一種交聯，也是嚴重的DNA損傷類型之一，同樣會阻滯DNA復制和翻譯。受到檢測技術重復性、靈敏性和特異性等方面的限制，與其它的DNA損傷類型相比，DPC的研究相對較少［13，29］。AP位點可在細胞和組織中自發產生，是多種生理過程中形成的最普遍的DNA損傷之一。由于AP位點與核小體中的組蛋白非常接近，以AP為中間體形成的DPC已被重點研究報道，如AP-Lys和AP-Cys（圖4）［28，32，68］。Chan等［28］用同位素稀釋LC-MS/MS方法首次從細胞中檢出新型的由AP位點與蛋白質的半胱氨酸（Cys）殘基發生反應形成的AP-Cys交聯，從HeLa細胞（Human cervix adenocarcinoma cell）中測得AP-Cys DPCs的本底含量為5．45個/107nts。近期，Chan等［32］再次利用LC-MS/MS方法首次定量分析了細胞內AP位點與賴氨酸（Lys）殘基反應形成的DPCs，檢測到HeLa細胞中AP-Lys DPCs的本底含量為0．03個/107nts。結果表明，在HeLa細胞中AP-Cys DPCs的含量高于AP-Lys DPCs，且與近期文獻報道的細胞中本底AP位點數目接近。此外，Tang等［69］基于DNA-蛋白質交聯測序技術，利用AP位點與Lys殘基共價結合的特點，應用于人類HEK293T細胞（Human embryonic kidney 293T cell）中胸苷乙二醇的全基因組圖譜繪制。表1列出了采用不同方法對細胞或哺乳動物組織中AP位點的檢測結果及特征分析比較。

圖4 由AP位點作為中間體形成的DNA-蛋白質交聯形成機制及對應生成的交聯加合物Fig．4 The formation mechanisms of DNA-protein crosslink derived from the AP site as intermediate and the corresponding crosslinked adducts

DPCs交聯的形成與修復機制亦值得深入研究，研究發現AP位點也可與多種修復酶如5′-脫氧核糖-5-磷酸/脫堿基裂解酶（KU）［70］、DNA聚合酶β（Pol β）［71］和多聚ADP核糖聚合酶1/2（PARP1/2）［72-73］等形成交聯，形成的DPC通常被認為是有害或短暫的中間體，且與AP位點的修復相關［31］。目前對AP位點作為中間體形成DPC的化學結構或生物學結局的了解很有限，仍亟待開發相應的檢測方法并深入研究［29，31］。

3 DNA脫堿基位點的檢測方法

當前檢測AP位點主要基于以下兩種方式。一種是非共價方式，依靠試劑與DNA分子間的氫鍵、范德華力和靜電引力等弱相互作用力，使檢測分子能夠進入AP位點，通過改變檢測分子的物理信號（如熒光和電化學），進而實現對AP位點的標記檢測［74］。另一種是共價標記AP位點的方式，依靠不同含氨基基團的標記試劑分子與AP位點的開鏈醛發生反應形成相對穩定的共價亞胺（通常稱為席夫堿）［75-77］（圖5），并進一步利用不同技術檢測標記分子實現對AP位點的分析。由于非共價標記方式基于弱相互作用力，其結合能力普遍低于共價反應探針，因此目前研究報道以共價標記方式居多，本文主要概述利用共價標記AP位點檢測方法的研究進展。

圖5 標記DNA脫堿基位點示意圖Fig．5 Schematic of labeling DNA abasic site

AP位點的重要檢測方法有14C或32P標記法、ELISA-like分析法、熒光分析法和LC-MS法等，其各具優勢和不足。其中，ELISA-like分析法是用于檢測和定量分析AP位點的常用方法之一，近年來，隨著高特異和高靈敏質譜技術的發展，質譜方法正逐漸成為AP位點檢測的主流方法。

3.1 14C或32P后標記法

14C標記法是利用同位素閃爍計數技術對AP位點的醛基基團和14C甲氧胺反應形成的肟類化合物進行檢測。該方法靈敏度和特異性均較低，無法實現對AP位點的準確定量［39-40，52］。Weinfeld等［42］使用32P后標記法可在fmol水平對DNA中的AP位點進行定量分析，方法靈敏度較高，但該方法需進行核酸凝膠電泳和色譜分離等前處理操作，費時耗力，且涉及放射性污染等問題［41］。因此，目前鮮有關于上述兩種標記方法的報道。

3.2 ELISA-like分析法

為應對上述14C或32P后標記法的不足，Kubo等［78］于1992年構建了一種生物素標記的含醛反應性探針（ARP）的ELISA-like方法。其原理是利用生物素標記探針的羥胺基團與DNA中AP位點發生加合反應，然后使用偶聯辣根過氧化物酶的抗生物素蛋白作為指示酶，通過ELISA-like方法對生物素標記的AP位點進行比色測定［43，78］。

該方法靈敏度較高且操作簡單，因此基于其改進的方法相繼被用于檢測和定量分析AP位點或含其它醛基的潛在DNA損傷［46，53，79-81］。Kubo等［78］在熱解或酸解后的CT-DNA或噬菌體f1 DNA中檢測到fmol水平的AP位點，該方法無需使用一抗和二抗，通過指征指示劑酶偶聯的抗生物素蛋白/生物素復合物直接檢測生物素和DNA的含量即可測定AP位點。Kubo等［44］在HeLa RC355細胞（具輻射抗性的HeLa細胞株）中測得的AP位點為＜1個/105nts［43］，在HeLa細胞中為5個/106nts（0．1 fmol）。

ELISA-like方法雖有較多應用，但由于缺乏特異性［48，55-56］，尚存在諸多局限：①該方法所使用的生物素在細胞中也同樣存在［49］；②ARP的結構空間體積較大［52］，因此ARP很可能因位阻導致未與AP位點充分反應；③DNA中存在的除AP位點之外的DNA氧化產物［82］、其它含醛基化合物如5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-甲酰基尿嘧啶（5fU）亦可能被錯誤標記［56，83-84］，存在假陽性風險。因此，近年來出現了基于其它原理的高特異性方法的報道和應用。

3.3 熒光分析法

相比于ELISA-like分析法，目前用于定量分析AP位點的熒光分析法應用仍較少，多數研究主要集中在如何提高檢測方法的靈敏度和特異性［48-49］。熒光分析法通過設計能與AP位點的開鏈醛反應的熒光探針分子，對熒光信號進行檢測并實現對AP位點的測定［18，48］。

使用常規含賴氨酸-羅丹明［18］和熒光素［85］標記的熒光分析方法分別能檢測到129 fmol和17 fmol水平的AP位點，其實驗操作所需時間雖比ELISA-like分析法少，但靈敏度較低，且所需DNA樣品量較大，洗滌后也難以避免痕量熒光探針的存在，從而影響分析結果。Fundador等［17］利用激光誘導熒光的毛細管電泳技術檢測熒光團-ARP標記的AP位點，靈敏度較前述熒光方法明顯提高，檢出限可達1．2個AP位點/106nts（0．02 fmol），但受限于必須采用合適的抗體，該方法的普適性較低。

最近，Liu等［48］測試了含萘二甲酰亞胺熒光標簽的羥胺探針分子與DNA中含醛基或酮基的化合物的反應能力，發現其均能與AP位點、5fU和5fC發生反應，三者反應效率并無較大差別。而以往研究報道中使用的羥胺或烷氧胺試劑僅標記了AP位點［18，47］、5fU［51，86］和5fC［87］中的一種化合物，推測其原因可能是實驗未考慮DNA中所有含醛基化合物或優化特殊反應條件所致［48］。因此，利用熒光分析法準確檢測AP位點或其它含醛基化合物時，除考慮適當的熒光標簽外，必須考慮結合特殊的反應條件以評估和優化熒光標記分子與目標物的反應效率［49，88］。

3.4 液相色譜-質譜法

液相色譜-質譜法是利用烷氧胺［50，52］或肼類［54］試劑對AP位點開鏈醛進行衍生標記形成穩定的肟或腙類目標化合物，實現對AP位點的準確定量分析。

Zhou等［52］基于14C甲氧胺衍生化構建了AP位點的加速器質譜法，檢出限為1個AP位點/106nts。該方法雖提高了靈敏度，但能與14C甲氧胺反應的除AP位點外，還包括鏈斷裂位點及多種帶有醛和酮基的降解產物，故該方法僅適用于檢測造成多位點損傷的DNA。Li等［54］利用同位素稀釋的LC-MS/MS法定量分析基因組DNA中的AP位點，檢出限為4個AP位點/109nts（6．5 fmol），該方法靈敏度雖有提高，但對AP位點的衍生化標記發生于DNA酶解完成后，存在DNA酶解導致假陽性AP位點生成的可能性，從而導致定量結果不準確。Rahimoff等［51］亦利用LC-MS/MS方法在小鼠胚胎干細胞中測得0．9個AP位點/106nts。Turesky等［50］構建基于利用O-［（3-吡啶基）甲基］羥胺（PMOA）試劑對AP位點進行衍生化標記的高靈敏和高特異性的LC-MS/MS定量方法，驗證了與提取DNA后對AP位點進行衍生化的流程相比，在細胞裂解時即直接對AP位點進行衍生化標記是減少假陽性結果的較好方式，并最終從小鼠肝組織中測得約0．9個AP位點/107nts。

質譜法測定AP位點靈敏度的不斷提高有益于實現對AP位點的分析檢測，同時質譜方法能提供精確質量及特征碎片離子，可實現精確定性與準確定量。但構建AP位點液質定量方法時除需考慮衍生化試劑的衍生化效率外，更需要考慮的重要影響因素是AP位點自身結構的不穩定性，由于在DNA裂解、消化或衍生化過程中均可造成AP位點的形成或丟失，易導致定量結果出現偏差，因而目前測定AP位點時需重點關注其化學穩定性［4，29，50］。通常考慮以下樣品處理條件，以盡量避免假陽性或假陰性結果：①條件盡量溫和，如酶解溫度不能太高、樣品混勻時輕輕振蕩及選擇適宜pH值等［50，89-90］；②酶解時添加劑的選擇，如加入甲磺酸去鐵胺能有效防止樣品被氧化［66，89-91］；③衍生化時機的選擇，如衍生化試劑越早添加越能監測到生物體本底水平的AP位點［50］。

如表1所示，在諸多測定AP位點的分析方法中，ELISA-like分析法和液相色譜-質譜法最為常用和有效。前者在人類細胞系中最少可檢出超過6．7個AP位點/107nts，最高在人或哺乳動物組織中檢出100個AP位點/107nts；后者在人肺臟或白細胞中最少檢出2個AP位點/107nts，最高在小鼠胚胎干細胞中測得10個AP位點/107nts。兩組數據比較分析顯示，對于細胞系或組織的AP位點本底水平測定，ELISA-like分析法測得的含量較高，其主要原因可能與ELISA-like方法的非特異性有關［55］。因此，目前亦日趨采用更特異更靈敏的LC-MS方法用于AP位點的檢測和定量分析。

表1 不同方法對寡核苷酸、細胞或哺乳動物組織中DNA AP位點的檢測分析特征總結Table 1 Summary of the characteristics of determination of DNA AP sites in oligonucleotides，cell lines or mammalian tissues by a variety of techniques

4 毒性評價和癌癥治療相關應用研究

4.1 毒性評價

自從報道在細胞內存在大量AP位點后，多數檢測方法的目的是測定AP位點在細胞或組織中的本底表達水平和經毒物暴露后的AP位點變化情況及損傷修復趨勢，并進一步研究其作為生物標志物用于損傷評價、BER修復過程檢測和化合物毒性評價等的可能性。

早期，人們利用ELISA-like分析方法開展了致癌物暴露細胞后AP位點的含量測定［44，46］、細胞中AP位點的修復過程監測［43］和老齡化過程中AP位點的變化程度［45］等研究，但由于該方法的特異性不強，導致上述研究可能存在較高的假陽性問題（見表1）。因此，近十五年來，陸續報道利用高靈敏和高特異的質譜技術對AP位點進行定性定量分析，但大多均停留在方法構建方面。近期Turesky課題組［50］構建了能有效降低假陽性的定量分析AP位點的LC-MS/MS方法，基于該方法，Guo等［58］開展了動物暴露于煙草中特異性亞硝胺形成AP位點的研究，并評估了吸煙者和非吸煙者DNA中的AP位點，為理解煙草中亞硝胺誘發癌癥的可能機制提供了一個新的角度。

4.2 癌癥治療

數十年來，人們對DNA損傷反應（DNA damage response，DDR）的理解不斷加深，拓寬了腫瘤學的治療領域。DDR缺陷導致的細胞基因組不穩定性誘發了癌癥的發生，但這些缺陷亦可被應用作為治療切入點，如選擇一些DDR途徑中成員的抑制劑進行癌癥靶向治療［92］。AP位點作為BER途徑中的修復中間體，是最常見的DNA損傷之一，基于AP位點的癌癥治療研究也逐步興起［93-94］。

Chen等［57］利用LC-MS方法測定了氮芥（NM）處理小鼠后各組織中NM-DNA加合物和AP位點含量，并繪制了二者之間的動力學曲線，發現AP位點的修復過程與NM-DNA加合物的清除有密切關聯，提示AP位點可作為用于新型化療方案設計和療效評估的生物標志物。近期，Mandi等［94］將AP位點作為抗癌藥物發現的靶標，發現熒光喹喔啉胺能增強特定雙功能烷基化藥物的反應，當含硝基的單喹喔啉DNA嵌入劑單獨或與熒光喹喔啉胺組合使用時可導致HCT-116細胞（Human colorectal carcinoma cell）凋亡，為后期靶向癌細胞中AP位點的治療應用提供了思路。Xue等［93］結合癌細胞中谷胱甘肽（GSH）的豐度，開發了具有靶向抗腫瘤活性和細胞光毒性的GSH響應性AP捕獲劑，為癌癥靶向化療提供了一種可能策略。

5 展望

AP位點損傷可由核苷酸自發水解產生，亦是DNA修復烷基化或氧化堿基過程中生成的中間體。若DNA中的AP位點未及時獲得修復，可能會導致DNA復制阻滯并影響轉錄過程，并進一步誘發細胞突變或細胞毒性。因此，通過體內或體外實驗探討AP位點損傷數目與細胞或哺乳動物組織中DNA損傷程度的關聯，以及驗證AP位點數目超過某一閾值可否作為判斷基因毒性的標志，對于AP位點損傷的定量分析研究顯得尤為重要［17-18］。由于AP位點結構的不穩定性，目前能準確定量分析AP位點的方法仍較少［29，50］。近年來，隨著利用LC-MS/MS技術定量分析AP位點損傷的研究逐漸增多［50］，已初步開展了人群受基因毒性物質如亞硝胺的暴露研究［58］，相信LC-MS/MS技術將在定量分析AP位點中扮演重要角色。

盡管AP損傷仍被認為是易于修復的致突變損傷，但AP位點的親電性使其在生物學效應中扮演的角色（如ICL或DPC）仍需獲得更多關注［2，28］，相信與AP位點相關的毒性評價和癌癥治療相關應用研究亦會逐步興起。