基于分子識別的農藥殘留快速檢測研究進展

陳可仁，李 潔，常巧英，許文濤*，龐國芳，2*

（1．中國農業大學 營養與健康系 食品精準營養與質量控制教育部重點實驗室，北京 100191；2．中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

自20世紀40年代被首次合成以來，有機磷殺蟲劑即憑借理想的殺蟲效果，在農業生產中得到了廣泛使用［1］。世界衛生組織將農藥定義為在農業生產中用于殺死昆蟲、真菌和雜草的化合物。目前世界上有超過千種農藥，包括殺蟲劑、除草劑、殺真菌劑和生長調節劑。為了提高農產品的質量和產量，全球每年在農業生產中使用的農藥達數百萬噸。盡管農藥的使用可以提高農業產值，但是其過度使用會對環境和生物體產生危害。農藥可以在土壤和水中殘留并通過食物鏈進行富集，含有超標農藥的食物被人類食用后，可導致眩暈、腹瀉、失明甚至死亡的嚴重后果［2］。因此，在當前農藥的使用仍然難以避免時，快速靈敏的農藥檢測成為保障食品安全的關鍵。

在過去的幾十年中，農藥檢測很大程度上依賴于高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）、質譜（Mass spectrometry，MS）和氣相色譜（Gas chromatography，GC）等技術的使用［3］。這些方法的靈敏度高、準確性好，但是通常需要昂貴的大型儀器和經驗豐富的專業人員，因此在農藥快速檢測中的適用性不高。在農藥檢測需求不斷增大的現狀下，農藥快速檢測技術的發展也越來越快。目前，多種分子識別機制已經應用于農藥的即時監測（Point-of-care testing，POCT）技術開發，識別元件的類別更是決定了檢測的速度、靈敏度及特異性，對于農藥POCT傳感器的開發意義重大。基于不同的分子識別方式（圖1），本文對農藥的快速檢測方式進行了歸納總結，并在表1中對不同識別方式的優缺點進行比較，以期為農藥的POCT提供研究思路。

表1 農藥殘留快速檢測中不同識別方式的比較Table 1 Comparison between different recognition strategies in the rapid detection of pesticide residues

1 基于生物識別的農藥殘留快速檢測

1.1 基于蛋白質的識別

基于蛋白質識別的農藥檢測是一種常見的檢測方式，該方法基于農藥與酶和抗體之間的相互作用進行檢測［2，4］。

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是生物神經傳導中一種重要的酶，當其被破壞時會對神經系統的生理功能產生影響［5］。因此靶向AChE的有機磷農藥或者氨基甲酸酯類殺蟲劑在被昆蟲攝入后可以通過對昆蟲體內的AChE進行抑制達到殺蟲效果。基于AChE的農藥檢測可以通過pH值、熒光強度、吸光度和電化學信號等實現信號輸出。2017年，Liu等［4］基于AChE催化水解產物可以誘導DNA構象變化實現滾環擴增反應（Rolling circle amplification，RCA）觸發的原理報道了一種用于農藥檢測的均質電分析平臺。如圖2A所示，RCA產生的G-四鏈體在沒有農藥分子存在的情況下可以對溶液中游離的亞甲基藍（Methylene blue，MB）進行捕獲，因此可以擴散到電極進行電子交換的MB數量較少，電化學信號較低；而當農藥分子存在時，由于AChE被破壞，RCA難以進行，大量MB與電極接觸，電化學信號較高，因此可以根據電化學信號的強弱確定樣品中的農藥含量。除了AChE，堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、有機磷農藥水解酶、酪氨酸酶和漆酶等也可用于農藥的檢測。Guo等［6］開發了一種多酶靶向的熒光探針，提高了農藥的檢測效率。

近年來，免疫傳感器憑借高親和力和高特異性的特點越來越多的應用于農藥檢測中。抗體對于農藥的識別可以通過多種機制轉換為直接可讀的信號，因此涉及熒光、比色和化學發光的免疫傳感器目前均在農藥檢測中得到應用。免疫傳感器通常可被分為三明治形式和競爭形式，由于農藥的特定性質，通常使用競爭形式的免疫傳感器進行農藥檢測。在這種檢測中，農藥分子通常與酶標記的半抗原（Hapten）競爭結合抗體，因此當農藥分子含量較高時，酶標記的半抗原僅能少量結合抗體，產生較低的輸出信號。Shu等［7］使用雙功能抗體開發了一種免疫層析試紙條，可以同時對甲基對硫磷和吡蟲啉進行檢測。如圖2B所示，用辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標記甲基對硫磷的半抗原得到HRP-hapten1，吡蟲啉的半抗原用ALP標記產生ALP-hapten2，將其與固定在檢測線上的抗體結合。加入協同反應劑后，兩種化學發光反應同時被觸發產生輸出信號，整個檢測過程可在22 min內完成。因為與靈敏度密切相關，所以半抗原的設計在這種檢測中十分重要。Wu等［8］提出了一種新的半抗原合成方法，即通過包被直接偶聯到載體蛋白上的抗原開發有機磷農藥的檢測試劑盒，這種方式克服了復雜的半抗原合成過程。

圖2 基于酶識別的生物傳感器用于有機磷農藥和氨基甲酸鹽農藥檢測（A）［4］；基于抗體的農藥檢測試紙條（B）［7］；比色傳感器檢測多菌靈的原理及結果（C）［17］；電化學傳感器檢測馬拉硫磷的原理（D）［21］Fig．2 Enzyme-based recognition biosensors for organophosphorus pesticides and carbamate pesticides（A）［4］，test paper for detecting pesticide compounds based on antibodies（B）［7］，the principle and performance of carbendazim detection by the colorimetric sensor（C）［17］，the principle of malathion detection by the electrochemical sensor（D）［21］

除了酶和抗體，肽也可用于農藥的檢測。Wang等［9］用肽標記的四苯基乙烯（Tetraphenylethylene，TEP）對有機磷農藥進行檢測，有機磷農藥可與肽形成復合物，促進肽的聚集并誘導肽標記的TEP熒光發射增強，檢出限為0．6 μmol·L-1。

1.2 基于核酸適配體的識別

核酸適配體是能特異性識別靶標物質且具有高度親和力的核酸序列，通常由SELEX篩選技術產生。1990年，Tuerk&Gold和Ellington&Szostak兩個課題組分別提出了SELEX篩選技術和核酸適配體概念［10-11］。此后，核酸適配體在隨后的30多年中迅速發展，應用范圍涉及生物傳感［12］、生物醫藥［13］、生物成像［14］和納米材料［15］等不同領域。

近年來，基于核酸適配體介導的分子識別技術在農藥快速檢測中受到廣泛關注。核酸適配體與其靶標結合的強大特異性及親和性助力了農藥的檢測識別過程。無論是高分子還是小分子農藥，適配體都具有很好的識別能力。并且，由于適配體易于修飾，因此可以與多種類型的信號輸出單元聯用，實現快速、靈敏、特異的POCT。適配體可應用于光學生物傳感器中，主要包括比色傳感器、熒光傳感器和化學發光傳感器。

金納米顆粒（Gold nanoparticles，AuNPs）在不同溶液環境下會呈現出分散或聚集的狀態，使溶液顏色發生變化［16］，因此經常用于農藥的比色傳感器中。2020年，Wang等［17］開發了一種由AuNPs和正電聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）組成的適配體傳感器，用于檢測廣譜殺菌劑多菌靈。如圖2C所示，當體系中不存在多菌靈時，表面為負電的金納米顆粒會與正電PDDA通過靜電作用形成穩定的復合物。在該狀態下，AuNPs呈分散狀，溶液為紅色。當體系中存在靶標時，多菌靈適配體優先與其結合，使得AuNPs無法與PDDA形成穩定復合物從而導致AuNPs聚集。聚集的AuNPs使溶液變藍，從而可依據溶液吸光度的變化實現多菌靈檢測，檢出限低至2．2 nmol·L-1，檢測范圍為2．2~500 nmol·L-1。該方法具有較好的靈敏度和特異性，能夠在水樣品中實現較高的多菌靈回收率（94．9%~105%）。

此外，有研究人員基于適配體與靶標的高親和力以及AuNPs的形貌與其催化作用之間的相關性構建了啶蟲脒的化學發光傳感平臺［18］，在過氧化氫和魯米諾存在的條件下，AuNPs能夠實現催化作用并產生電化學發光現象，基于電化學信號的變化可實現啶蟲脒的高靈敏檢測，檢出限低至62 pmol·L-1。

熒光信號也是一種常用的輸出信號。在生物傳感器中，可以通過引入具有熒光特性的分子進行信號輸出。2018年，Wangoo和Sharma以及Lu團隊分別利用不同的適配體實現了馬拉硫磷和水胺硫磷的快速檢測［19-20］。他們通過相似的策略，即待測靶標加入前后，適配體構象的變化導致體系中游離核酸單鏈的數量不同，基于適配體與納米材料的相互作用使體系的熒光值發生變化，進而實現農藥的定量檢測。相較而言，馬拉硫磷生物傳感器的檢測性能（檢出限為4 pmol·L-1）優于水胺硫磷生物傳感器（檢出限為10 nmol·L-1）。

除了光學傳感器，基于適配體識別的電化學生物傳感器同樣可以實現農藥的高靈敏檢測。2019年，有研究人員成功搭建了一種用于馬拉硫磷超靈敏檢測的適配體生物傳感器（圖2D）［21］。該傳感器由聚合物和多壁碳納米管組成，適配體被化學修飾在電極表面。該電化學傳感器在0．1 fmol·L-1~1 μmol·L-1范圍內具有良好線性，檢出限低至0．5 fmol·L-1。此外，Xu等［22］在2020年提出了一種創新性的電化學適配體傳感器，該傳感器包含高孔隙率金和適配體，可用于啶蟲脒的檢測，其線性范圍為0．5~300 nmol·L-1，檢出限為0．34 nmol·L-1。

相比于抗體，基于適配體的識別方式在小分子農藥的定量檢測中具有顯著優勢。核酸適配體的高特異性、親和性、易于修飾且容易改造裁剪的特性使其在農殘檢測領域的應用越來越廣泛和靈活，其穩定性、易得性和低成本更是在檢測產品的開發方面獨具優勢。

2 基于非生物識別的農藥殘留快速檢測

2.1 基于無機納米材料的識別

近年來，無機納米材料成為材料科學、納米醫學、計算機科學和化學催化等領域的研究熱點。越來越多的無機納米材料在應用中發揮了分子識別功能。

分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymer，MIP）也被稱為化學抗體，具有較高的機械性能和化學穩定性，并且易于大規模制備和重復利用，能特異性地結合到特定化學分子上，因此在檢測領域應用廣泛［23］。MIP可以與眾多具有輸出信號特性的材料聯合用于農藥檢測。2020年，有研究人員組裝了一種MIP上轉換納米顆粒（UCNPs），能夠在20~800 ng·mL-1范圍內實現啶蟲咪的精準定量，檢出限低至8．3 ng·mL-1，具有良好的檢測能力（圖3A）［24］。此外，MIP還可與碳量子點［25］、金屬納米顆粒［26］和熒光分子［27］等其他納米材料結合，用于農藥POCT。

金屬有機框架（Metal-organic frameworks，MOFs）由于結構的規則性、合成的可控性以及獨特的化學特性，在不同領域的應用被不斷探索［28］。通過對骨架的適當設計，MOF可基于主客體相互作用與特定分子特異性結合進行農藥識別。2020年，Xu等［29］基于鋅MOF結構與熒光配體特異性識別的原理組裝了光學傳感器，該傳感器能夠選擇性識別巴拉松并實現了低至1．950 μg·L-1的超靈敏檢測。此外，其他納米材料如金屬納米片等同樣可以實現農藥的靈敏和快速檢測［30］。

納米材料易得、制備成本低廉，還具有良好的催化性能和信號輸出等多元功能，加之其出色的比表面積和卓越的穩定性，近年來在分子識別方面受到了廣泛關注。但是，該領域還在發展和完善的過程中，納米材料與農藥分子的特異性識別機制有待進一步探究，以助力理想的農藥POCT產品開發。

2.2 基于大環化合物的識別

大環化合物是一類具有選擇性的熒光試劑，常見的大環化合物有環糊精、瓜環、冠醚和杯芳烴等，近年來這些物質在農藥的檢測中也逐漸被使用［31］。基于大環化合物的農藥鑒定方法通常將大環化合物與熒光物質相結合，當農藥分子存在時，在非熒光大環化合物的作用下，熒光團與農藥相互影響，從而使熒光能量改變，產生輸出信號以實現農藥的檢測。基于這種原理，2020年，Zhang等［32］合成了3種不同咔唑基團修飾的多孔有機聚合物，并利用這些聚合物制備了農藥檢測試紙（圖3B）。該試紙在接觸三氟脲水分散液時表現出快速的熒光響應，在循環使用12次后仍具有良好的靈敏性。利用大環化合物進行農藥檢測的另一種策略是利用農藥對大環封閉的熒光分子進行置換以實現熒光的釋放。2021年，Xu等［33］使用農藥對大環化合物中質子化的吖啶進行置換實現了多果定的檢測。當多果定存在時，其可將熒光被抑制的質子化吖啶從葫蘆［10］脲中移出，使其強熒光恢復。

圖3 分子印跡上轉化納米顆粒的制備及檢測原理（A）［24］；用于水中農藥檢測的咔唑基單體的合成（B）［32］；一種可重復使用的SERS納米多孔銀片用于農藥檢測（C）［39］；直接從水果和蔬菜表面取樣農藥的擦拭技術用于DART（D）［47］Fig．3 The construction of molecularly imprinted upconversion nanoparticles and the detection principle［24］（A），synthesis of carbazolids for pesticide detection in water［32］（B），a reusable SERS nanoporous silver sheet for pesticide detection［39］（C），swabbing technique employed to sample pesticides directly from fruit and vegetable surfaces for DART［47］（D）

3 基于直接識別的農藥殘留快速檢測

除了需要借助識別元件實現的農藥殘留快檢方式外，隨著生物技術及儀器分析領域的發展，多種基于儀器的直接分析方法也被不斷開發。這些方法能夠根據農藥固有光學性質及化學性質的不同，在無需引入識別元件的條件下實現直接、快速、靈敏、無損、低成本的農藥殘留超靈敏檢測［34］。

3.1 基于農藥光學性質的識別

根據物質的光譜特性對其化學成分進行分析是分析化學中一項重要的分析技術，具有快速、高效和無損的特點，在農藥檢測中被廣泛使用。

拉曼光譜是使用最為廣泛的一種光譜技術，1928年，Raman和Krishnan首次觀察到了拉曼光譜這種非彈性光散射現象，可以根據不同的振動和旋轉拉曼光譜提供分析物的分子指紋特異性。盡管拉曼光譜可以對不同的分子進行識別，但是由于其散射橫截面小，因此不適用于痕量物質的檢測，表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）的出現很好地解決了這一問題［35］。1974年，Fleischmann等首次將拉曼光譜用于研究電極吸附作用，發現當分析物靠近金屬顆粒表面或者被金屬顆粒吸收時其拉曼散射信號增強［36］。1987年SERS第一次被用于有機磷農藥的檢測［37］，此后越來越多基于SERS的農藥檢測方法被開發。2021年，Sun等［38］報道了一種三維分層多孔功能SERS基底Cu@Co3O4@Ag-H，可以提供大量的電磁增強位點，并且可在2 s內對痕量液滴進行快速感應，利用該傳感平臺可實現水果和蔬菜表面農藥殘留的快速檢測，檢出限為0．1 mg·L-1。通常，金、銀作為SERS的基底物質時可實現較好的信號增強效果。為了解決昂貴基底物質對檢測的限制，Chi等［39］在2020年報道了一種可重復使用的納米多孔銀片，該銀片可以通過超聲波進行清洗，在重復使用20次時仍然保持良好的SERS活性（圖3C）。此外，Logan等［40］還開發了手持式SERS和安全高效的醋酸鹽提取方式聯合使用的檢測技術，對印度香米中的4種農藥進行檢測，實現了低于10 μg·L-1的檢出限。

基于可以選擇性吸收某些波長紅外線并發生能級躍遷的特點，紅外光譜也可用于物質的檢測。Jamshidi等［41］利用可見/近紅外光譜結合偏最小二乘回歸判別分析實現了快速無損的黃瓜中農藥的殘留檢測。González-Martín等［42］利用同樣的方法對106個蜂膠樣品進行農藥殘留檢測，并與GC-MS的檢測結果進行比較，發現該方法具有代替GC的潛力。

3.2 基于農藥化學性質的識別

不同類別的農藥化學性質各異。質譜技術的檢測靈敏度極高且對樣品用量的需求較低，因此在食品藥品等領域成為有效的實驗室分析手段之一。為了實現農藥POCT檢測，近年來已有多種快速、現場檢測平臺被不斷開發。2005年，Cody等［43］提出了實時直接分析（Direct analysis in real time，DART）技術，并將DART與高分辨率飛行時間質譜儀聯用，通過精確的質量測量得到了更高選擇性和更準確的元素組成分配信息。實時直接分析質譜（Direct analysis in real time mass spectrometry，DART-MS）結合了非表面接觸分析手段與離子化質譜分析技術的優勢，無需真空環境，在大氣壓條件下即可對不同狀態、形態的樣品實現精準、靈敏、無損的原位定量分析，并且樣品前處理過程簡單，在特定條件下甚至無需樣品前處理過程即可滿足高通量、現場、快速、原位、無損的樣品分析需求。DART-MS目前在食品［44］、醫藥［45］和環境分析［46］等領域已經取得了不錯的研究進展。

DART-MS技術同樣被廣泛應用于農藥檢測領域。2012年，有研究學者通過DART-MS技術分析了水果和蔬菜表面的農藥殘留量［47］。他們使用拭子擦拭果蔬表面，實現了櫻桃番茄、橙子、桃子和胡蘿卜等多種樣品的農殘快速分析（圖3D），檢測到的農殘類型包括馬拉硫磷、甲胺磷、噻菌靈、抑霉唑和樂果等，其檢出量均遠低于國家限值要求。為了提高檢測的選擇性和準確性，Lara等［48］將DART與高分辨率質譜聯用實現了生菜和芹菜等復雜樣品中農藥的定量檢測。結果表明，該技術至少能夠定量7種高極性農藥，檢出限為20~60 μg·kg-1，樣品回收率為71．0%~115%。此外，Kiguchi等［49］采用薄層色譜/實時直接分析飛行時間質譜（TLC/DART-TOF MS）和同位素稀釋技術同時分析了脂肪食品中的極性和非極性有機磷殺蟲劑，發現苯硫磷和二嗪磷在較低含量范圍（0．05~5 μg）具有良好的線性關系，而乙酰甲胺磷、甲胺磷和殺螨硫磷則在2．5~25 μg的高含量范圍內呈現相對理想的檢測效果。

此外，解吸電噴霧電離質譜法（Desorption electrospray ionization mass spectrometry，DESI-MS）能夠利用霧化溶劑噴霧對樣品表面分析物進行解析和電離，實現對半極性和極性物質的特定分析。該方法由普渡大學Cooks研究團隊首先提出，并于2006年應用至成像領域［50-51］。近年來，該方法在農藥分析中也取得了一定的應用進展。2009年，國內研究團隊基于DESI-MS方法實現了白菜葉片上莠去津殘留的精準、靈敏檢測［52］。此外，Gerbig等［53］利用DESI-MS方法檢測了芒果、百香果、木瓜和草莓表面的農藥殘留，完成了24種農藥的快速檢測，其檢出濃度遠低于食品污染物最大殘留限量。

4 結論與展望

在農藥POCT中，基于生物與非生物識別方式均可實現農藥的特異性識別。相比于非生物識別方式，生物識別元件的安全性強、操作便捷，但穩定性相對較差。傳統的基于酶的農藥識別方式依賴于酶的特定性質和緩沖體系，基于該原理的傳感器在穩定性、特異性和選擇性上均有一定的提升空間；而基于非酶識別的傳感器具有優越的親和性、特異性和穩定性，并且對農藥種類無特定限制。基于非生物識別原理搭建的傳感器的穩定性強，易于制備和獲得，但有時需要特定儀器輔助才能完成檢測。如SERS和DART-MS分析技術在農殘分析領域雖已取得一定進展，但在儀器便攜性和操作簡便性方面還需進一步提高。另外，納米材料具有優越的穩定性和獨特的酶活及光電特性，也是一種值得關注的新興識別元件。總之，基于不同識別模式開發的農藥傳感器基本能夠滿足對復雜樣品中待測農藥的高特異及高靈敏檢測需求，但仍需發展更加出色的檢測識別模式。目前可通過液體均相和固相裝置實現POCT產品的開發，如側流層析試紙條、微流控裝置和檢測試劑盒。未來，除了滿足快速、靈敏和穩定的檢測需求外，還應使檢測裝置適用于不同樣品基質并簡化樣品前處理步驟，以實現卓越的現場檢測效果，更好地滿足市場需求。