拉曼光譜檢測手性化合物研究進展

李 丹，胡瑞琪，李攻科，夏 凌

（中山大學 化學學院，廣東 廣州 510006）

手性是自然界中的一種常見現象，不僅與生物密切相關的蛋白質、氨基酸、糖、酶等物質都有手性，許多藥物和農藥也具有手性［1］。手性化合物的結構和理化性質非常相似，但藥效和毒性卻有很大的差別［2-3］。例如，L-3，4-二羥基苯丙氨酸是目前治療帕金森最有效且應用最廣泛的藥物，而D-3，4-二羥基苯丙氨酸不僅沒有藥理活性，還對人體有害［4］。因此，建立準確、高效的手性化合物檢測方法具有重要意義。迄今為止，已有許多分析技術用于手性化合物的檢測，包括高效液相色譜法［5-6］、比色法［7-8］和熒光法［9-11］等。盡管這些技術在推動手性化合物的分析和檢測中已有較大進展，但隨著手性化學的發展，如何實現復雜體系中手性化合物、樣品表面手性以及多手性中心化合物的檢測等成為今后發展手性分析化學最大的挑戰，選擇合適的光譜技術以建立高效、準確檢測手性化合物的方法具有重要的現實意義。

拉曼光譜具有無損和檢測快速等優點，并能提供化合物特有的“指紋信息”，在分析手性化合物方面顯示出很好的發展潛力。目前，用于檢測手性化合物的拉曼光譜主要有拉曼光學活性（Raman photoactivity，ROA）光譜、對映選擇性拉曼（Enantioselective Raman，esR）光譜、低頻拉曼（Low frequency Raman，LFR）光譜以及表面增強拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）光譜。ROA光譜法是傳統的手性化合物檢測方法，其測量結果準確，但是由于光譜信號弱、檢測時間長，檢測效率受到極大限制［12-14］。相對于ROA光譜，esR光譜檢測速度快、成本低，但由于數據處理困難［15-17］，目前很少用于手性化合物的檢測。與ROA光譜和esR光譜不同，LFR光譜和SERS光譜無需依靠偏振光的作用，LFR光譜檢測的關鍵在于如何解析拉曼光譜的低頻區信息［18-19］；而SERS光譜是以SERS基底為基礎，通過放大基底與不同手性化合物間的相互作用進行檢測。另外，SERS光譜法和其他方法聯用也為手性化合物檢測提供了一種新思路［20-22］。本文綜述了ROA光譜、esR光譜、LFR光譜以及SERS光譜檢測手性化合物的研究進展，并對目前存在的問題及未來研究趨勢進行了總結和展望。

1 拉曼光學活性光譜

ROA光譜是一種用于手性化合物檢測的特殊的拉曼光譜技術，來源于手性化合物左右圓偏振光的差分拉曼散射［12-14］，因此對物質的手性結構非常敏感［23-24］，是傳統的手性化合物檢測方法。得益于其在手性化合物檢測方面的優勢，ROA光譜最近在立體化學［25-26］、生物化學［27］、制藥［28-29］和生命科學［30］等領域有廣泛應用。

1993年，Polavarapu等［31］利用ROA光譜成功地確定了有機硫化物的絕對構型。這是首次利用ROA光譜法對手性化合物進行檢測。然而受限于當時的實驗條件，在接下來的十年中研究相對較少。2007年，Hug等［32］利用ROA光譜對手性氘代新戊烷進行了識別，再次展現了ROA光譜在手性檢測方面的優勢。隨后，Chruszcz-Lipska等［33］通過ROA光譜法檢測了西伯利亞冷杉針油中的乙酸龍腦酯對映體，首次采用ROA光譜完成了對復雜體系中手性化合物的檢測。另外ROA光譜還可用于手性固體樣品的檢測，Hasegawa等［34］通過ROA光譜法對全氟烴基化合物的結晶固體樣品進行分析，發現其具有顯著的光學活性，成功實現了全氟烴基化合物對映體的區分（圖1）。圖1A是用于掃描ROA光譜儀的拉曼成像顯微鏡，該儀器由電荷耦合元件（Charge-coupled device，CCD）、光柵、物鏡、邊緣濾波器以及激發波長為532 nm的激光器組成。為了實現ROA的測量，需在物鏡上方放置一個λ/4波板，以形成右旋或左旋的圓偏振光對樣品進行照射（圖1B）。圖1C是儀器的安裝示意圖，其中邊緣濾波器能起到消除瑞利散射光的作用，當進行ROA檢測時，邊緣濾波器會將消除瑞利散射光后的拉曼散射光引入光柵中，最后借助CCD對其進行檢測。圖1D是物鏡與樣品相距高度的示意圖，其中物鏡的共焦孔內徑為25 μm。用此裝置進行ROA檢測，可以得到具有10 μm內徑和30 μm深的激光斑點的拉曼光譜。

圖1 用于ROA檢測的儀器總體視圖（A）；樣品室內部（B）；安裝示意圖（C）；焦點距樣品表面的高度（D）［34］Fig．1 Overall view of the apparatus for ROA measurement（A）；inside of the sample room（B）；diagram of the setup（C）；the height position of the focal point from the sample surface（D）［34］

然而，ROA信號強度通常比傳統拉曼光譜弱3~5個數量級［35］，且所需樣品濃度高、采集時間長，應用受到很大限制。為了提高ROA光譜的檢測效率，Li等［36］設計了一款以457 nm激光器作為光源的短波長ROA儀器，其靈敏度比商用的532 nm手性拉曼光譜儀高。短波長手性拉曼光譜儀的成功研制，實現了低功率、短時間、低濃度手性化合物的ROA檢測［37］。此外，結合密度泛函理論計算［38］、機器算法［39］等技術手段也能加強ROA光譜對手性化合物的檢測效率。

2 對映選擇性拉曼光譜

傳統的ROA光譜能較好地檢測手性化合物，但其光譜信號弱、檢測時間長。為了提高檢測效率，Kiefer等［40］提出了一種全新的基于偏振分辨信號的拉曼手性檢測方法，即esR光譜。該法僅需將半波延遲器添加到自動偏振分辨拉曼裝置中，即可進行手性化合物的檢測。與ROA光譜類似，esR光譜還充分利用了手性化合物的光學活性，即當線偏振光照射在樣品上時，裝置檢測臂中的半波延遲器會使拉曼信號產生相位偏移［17］，導致對映體光譜的對稱性被破壞，從而達到檢測手性化合物的目的。

2018年，Kiefer等［41］利用esR光譜對手性2-丁醇進行分析，首次將esR光譜用于手性化合物的檢測。隨后，他們將esR光譜與部分最小二乘回歸相結合，成功地確定了手性化合物5，6-二苯基-嗎啉-2-酮的對映體純度［42］。最近，Kiefer等［43］將esR光譜與多元數據分析方法相結合，對手性醇4-甲基戊-2-醇進行了分析，這項工作展現了esR光譜在檢測手性化合物中的潛力。但是該項技術目前尚處于起步階段，未來還需要更多的研究人員加入以推進其走向成熟。

3 低頻拉曼光譜

LFR光譜又稱低波數或太赫茲拉曼光譜，與目前常用的中頻拉曼光譜相比，具有維護成本低、實驗設置靈活、檢測時間短等優點［18-19］。不同于ROA光譜和esR光譜，LFR光譜可以獲得拉曼光譜低頻區域的信息。因此，在不依賴于偏振光的作用下，僅通過分析拉曼光譜低頻區域的特征峰信息，即可實現手性化合物的檢測。這是因為拉曼光譜的低頻區域信息豐富，且極易受極化變化的影響。然而，大多數的拉曼光譜儀都不能得到低頻區的信息。近年來，體全息光柵的發展使LFR光譜檢測成為可能。目前采用LFR光譜檢測手性化合物的研究較少，Aviv課題組在該領域做出了突出貢獻［44-46］。

大多數拉曼光譜只能檢測溶液中的手性化合物，很少用于手性固體樣品的檢測。2017年，Aviv等［44］首次提出利用LFR光譜對手性固體樣品進行檢測，成功實現了對氨基酸外消旋晶體和對映體純晶體的分析。隨后，Aviv等［45］利用LFR光譜法成功測定了晶體的對映體過量值，該法簡單、快速，具有較高的手性靈敏度，為晶體表面的手性表征提供了一種新的方法。最近，Aviv等［46］通過對傳統拉曼儀器的光學設置進行調整：在激發路徑中添加半波延遲器，在收集路徑中添加Glan-Taylor偏振器，最終成功檢測了3對手性氨基酸（圖2A）。在傳統的拉曼裝置中，其焦錐是對稱的（圖2B），當偏振光入射到對映體上時，D-對映體和L-對映體分別順時針和逆時針旋轉相同的角度，無法實現手性化合物的檢測（圖2C）。而通過上述調整后可產生不對稱的焦錐（圖2D），這種不對稱會形成不對稱散射截面。與傳統的拉曼裝置不同，改進后的裝置能夠選擇激發和收集信號的偏振平面。當以偏振光束激發時，由于焦錐的不對稱性，使得各偏振平面所采集到的拉曼信號強度不同。通過比較LFR信號的強度即可實現手性化合物的分析，該方法顯示出LFR光譜作為一種通用的對映體鑒別工具的潛力（圖2E）。

圖2 LFR實驗裝置示意圖（A）；傳統的拉曼激發（B）及收集的焦點區域示意圖（C）；改進的拉曼激發（D）及收集的焦點區域示意圖（E）［46］Fig．2 Schematic diagram of the experimental setup of LFR（A）；schematic representation of conventional Raman excitation（B）and its collected focal area（C）；schematic representation of the modified Raman setup excitation（D）and its collected focal area（E）［46］

LFR光譜的檢測重點在于對拉曼低頻區的信息進行解析，以便快速分析手性化合物。然而，目前掌握的拉曼低頻區信息有限，因此很難對拉曼峰的歸屬進行分析。同時，隨著光譜分辨率的提高，其檢測效率也會隨之下降。因此，如何平衡好二者的關系，進一步提高檢測效率，將成為今后LFR技術發展的一個重要方向。

4 表面增強拉曼散射光譜

傳統的拉曼手性檢測方法靈敏度低，限制了其應用。雖然通過增加激光功率可以提高檢測方法的靈敏度，但這往往伴隨著儀器的大型化和裝置的復雜化，不適合現場實時檢測［20-22］。近年來，SERS光譜在檢測手性化合物方面顯示了很好的應用前景。在SERS基底的作用下，SERS光譜不僅能實現手性化合物的檢測，而且極大地提高了檢測的靈敏度。另外，SERS光譜還能與其他方法聯用檢測手性化合物。

4.1 基于SERS基底的手性檢測

SERS基底是利用SERS光譜法檢測手性化合物的關鍵［47-49］。當手性化合物與SERS基底作用時，會導致周圍環境發生輕微變化。由于SERS光譜對周圍環境的微小變化非常敏感，因此可以利用SERS光譜捕捉的手性化合物與周圍環境相互作用所產生的微小差別，實現手性鑒別。

手性SERS基底可以為手性化合物檢測提供手性環境。不同對映體分子間存在空間結構的差異，當二者相互作用時，會形成不同的氫鍵配合物，通過SERS光譜識別和轉換后，會產生SERS信號強度的差異［50］，最終實現對各種手性化合物的檢測［51-54］。Jin等［55］以手性二氧化硅為模板，將聚多巴胺（PDA）和銀納米顆粒沉積于其上，制備了SiO2/PDA/Ag納米復合材料。隨后去除SiO2模板，得到具有SERS活性的手性PDA/Ag基底，基于氨基酸對映體與手性PDA/Ag基底作用時會顯示不同的SERS信號強度，成功實現了對酪氨酸和苯丙氨酸對映體的檢測。除了利用手性模板合成SERS基底以提供手性環境外，還可利用手性配體直接合成手性SERS基底。Lyutakov等［56］通過對同手性金屬有機框架（MOF）進行金光柵表面接枝，構建了手性檢測傳感器。其中，金光柵表面可激發表面等離子體激元波，有助于產生電磁增強。手性金屬有機框架負責選擇性捕獲溶液中的對映體，促進SERS的化學增強。最后基于對映體在手性基底上SERS信號強度的差異，實現了甲基苯亞砜、半胱氨酸和多巴對映體的選擇性識別和檢測。Xu等［57］以谷胱甘肽對映體作為手性穩定劑，基于鉑骨架制備了具有強烈手性光學響應的手性三角金納米環（TNRs）。手性三角金納米環不僅可用于檢測手性化合物，還可確定Aβ42蛋白錯誤折疊和聚集的過程（圖3A）。這項研究開辟了基于手性SERS基底早期診斷蛋白質錯誤折疊疾病的新途徑。最近，Guselnikova等［58］開發了一種手性MOF膜包覆的金基底，能夠實現血漿中手性偽黃麻堿的原位SERS檢測，其檢出限低至1．0 pmol/L。實驗結果表明，SERS可以在復雜體系中檢測手性化合物。

然而，手性SERS基底制備困難，制約了手性SERS檢測方法的發展。最近，Wang等［59］發現基于拉曼探針分子、SERS基底和手性目標物之間的電荷轉移（CT）效應，可在不依賴手性SERS基底和偏振光的情況下實現手性化合物的檢測。首先利用拉曼探針分子與SERS基底形成氫鍵組裝體系，當引入不同的手性化合物后，會導致SERS光譜產生差異（圖3B）［60］。Wang等［61］將Ag溶膠基底浸入對巰基吡啶（MPY）溶液中，構建了Ag-MPY組裝體系。將手性醇對映體引入體系后，MPY分子與對映體之間會形成不同的CT效應，最終根據SERS特征峰的相對強度差異，實現了手性醇分子的檢測，首次證明CTSERS適用于手性化合物的檢測。隨后，Wang等［62］將TiO2NPs引入到構建的手性傳感器中，制備了Ag-TiO2-Ag三明治基底，TiO2的引入改善了體系的CT行為，提高了對手性化合物的檢測效率，同時β-環糊精的引入實現了對手性目標物的立體選擇性捕獲，放大了對氨基硫酚的手性差異，最終實現了各種氨基酸對映體的檢測。最近，Wang等［63］利用n-六硫醇、對巰基苯硼酸和垂直排列的Au-NRs陣列組成手性檢測傳感系統，基于手性芳香分子與手性檢測傳感系統間不同的氫鍵作用，借助CT-SERS成功地鑒定了10多種手性芳香分子。以L/D-扁桃酸的檢測為例，對該法的手性鑒別機制進行分析。研究發現，含有疏水芳香環的L-或D-扁桃酸容易被n-六硫醇通過范德華作用和疏水作用拉入基底附近，因此可被靈敏地檢測到。另一方面，扁桃酸對映體的親水羧基和羥基則通過氫鍵與鄰近的對巰基苯硼酸的羥基相互作用。由于扁桃酸對映體存在不同的空間結構，這導致所形成的復合物具有不同的電子結構和CT過程，使兩個對映體系統出現了不同的SERS光譜（圖3C）。該法展現了CT-SERS檢測手性化合物的巨大潛力。

圖3 手性Pt@Au TNRs基底的合成路線及Aβ42檢測示意圖［57］（A）；對映選擇性傳感器的制備過程示意圖［60］（B）；傳感器與L/D-扁桃酸對映體在鑒別過程中的相互作用示意圖［63］（C）Fig．3 Synthesis route of chiral Pt@Au TNRs substrates and schematic diagram for Aβ42 detection［57］（A）；an illustration of the fabrication processes of the enantioselective sensor［60］（B）；schematic diagram of interaction between sensor and L/D-mandelic acid enantiomer during identification［63］（C）

4.2 SERS聯用技術

近年來，多模態檢測方法受到了廣泛的關注。這種方法可以整合多個分析系統的相關參數和信息，大大簡化了分析檢測過程。目前SERS已與多種技術聯用實現了手性化合物的檢測［64-68］，如SERS手性各向異性［69］、SERS-手機濕潤性測量［70］、SERS-電化學法［71］、峰值擬合輔助SERS［72］等。

Che等［69］借助手性納米結構金膜為SERS基底構建了SERS手性各向異性（SERS-ChA）檢測平臺，該平臺可以利用線偏振光或非偏振光通過SERS來區分對映體（圖4A-i）。SERS-ChA被定義為同一手性平臺上對映體分子的SERS強度差異，即SERS-ChA=IS-IR，其中IS和IR分別為S和R對映體的SERS強度。同時提出了g因子，即gSERS-ChA=2（IS-IR）/（IS+IR）。最大的lim|g|max=2表示對映體可以實現完全區分（圖4A-ii）。當檢測和量化一個未知樣品時，首先需要建立一個標準曲線，然后將被測化合物稀釋到SERS-ChA標準曲線中的濃度，通過測定混合樣品在手性SERS基底上的拉曼信號值，代入標準曲線即可得到未知樣品的絕對構型和對映體過量值，實現手性化合物的檢測（圖4A-iii），該方法無需預先分離待測樣品，操作簡單、成本低、靈敏度高。Lyutakov等［70］研制了一種基于手機潤濕性測量和SERS的雙模手性傳感芯片，通過在常規的金光柵表面共價嫁接手性識別分子，即L/D-酒石酸，使手性胺的立體選擇性識別成為可能。胺的手性感應包括兩種分析模式，首先，由手性胺的對映選擇性夾帶引起的潤濕性變化，可以通過手機應用程序進行監測和分析。其次，基于該芯片的SERS測量可以提供胺的化學結構信息，并可非常準確地計算出對映體的過量值。所開發的芯片適用于各種手性胺的檢測，包括分析溶液中的酪氨酸、半胱氨酸、多巴胺和含有3，4-二羥基苯丙氨酸（DOPA）的商用藥物中的右美沙芬（圖4B）。Ling等［71］將不對稱納米多孔金碗（Nanoporous gold bowls，NPGB）與電化學-SERS（EC-SERS）聯用，成功獲得了對映體的特異性分子指紋，實現了對手性色氨酸的無標記SERS檢測。其中，NPGB上的表面原子缺陷可形成局部不對稱位點，以誘導手性化合物與NPGB間的相互作用；而外部電位可以最大程度地促進二者相互作用，實現SERS信號的放大，最終表現出SERS峰強度比率的明顯變化。結合化學計量分析，可以進一步精確地量化對映體的比例。該法在疾病診斷和藥物質量控制方面展現出良好的應用前景（圖4C）。

圖4 SERS-ChA鑒別對映異構體的示意圖［69］（A）；L-或D-酒石酸涂層金光柵的制備示意圖［70］（B）；NPGB/EC-SERS策略檢測對映異構體的示意圖［71］（C）Fig．4 Schematic illustration of the SERS-ChA method for enantiomer discrimination［69］（A）；schematic of the preparation of L-or D-tartaric acid coated gold gratings［70］（B）；schematic illustration of the NPGB/EC-SERS strategy for differentiation of enantiomers［71］（C）

5 結論與展望

本文主要從ROA光譜、eSR光譜、LFR光譜及SERS光譜4個方面介紹了拉曼光譜在手性化合物檢測中的研究進展，并對各種方法的優缺點及應用場景進行了詳細的討論。其中ROA光譜、eSR光譜及LFR光譜主要借助偏振光及改進的拉曼光譜儀器，通過增強體系的手性信號達到檢測目的；而SERS光譜則依靠材料與手性化合物的相互作用，實現手性化合物的檢測。

雖然目前拉曼光譜可以在一定程度上實現對手性化合物的檢測，但仍存在許多問題：（1）傳統的拉曼光譜靈敏度低，限制了拉曼手性分析的進一步發展；（2）現有的拉曼手性分析大多局限于手性標準品的檢測，在復雜體系中的應用較少；（3）手性拉曼檢測方法大多依賴于偏振光及手性環境的作用，檢測成本高、操作復雜。為了提高拉曼光譜在檢測手性化合物方面的實用性，還需：（1）緊跟物理學和電子學的發展，將信號增強理論和拉曼光譜儀器的研制引入到研究中，提高檢測效率；（2）結合前處理技術，消除基體干擾，快速檢測復雜手性樣品；（3）開發雙模甚至多模檢測方法，例如結合拉曼光譜和手性試劑衍生化法，簡化檢測過程。此外，在分析復雜體系時，往往需要結合精細的數據處理方法，以機器學習輔助拉曼手性分析也是未來研究的重點。拉曼光譜檢測手性化合物的研究方興未艾，作為具有發展潛力的分析檢測方法，依靠拉曼光譜檢測手性化合物將越來越受到人們的重視。