成組毒理學分析儀在污染物識別與毒性測試中的應用

楊曉溪，李姿慷，郭云鶴，劉艷娜，王 易，聶 童，周群芳，史建波，曲廣波，江桂斌

（中國科學院生態環境研究中心，環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085）

隨著工業的快速發展和科技的飛速進步，每年新合成的化學品不斷涌現，但受到監管的化學品十分有限，進入環境中的潛在污染物數量以驚人的速度迅猛增加。環境污染被認為是當今世界誘發人類疾病甚至導致死亡的重要因素［1］，我國環境污染所導致的健康問題也已突顯［2］。化學品隨著人們的生產生活釋放到各類環境介質或食品中，種類繁多，復雜多變，一些化學品可在極低濃度下產生毒性，而一些本無毒性的物質可與其他化合物協同發揮更強的毒性作用，呈現出復合毒性效應［3］。此外，化學品在復雜介質中的遷移轉化會產生各類轉化產物，其毒性作用可能強于母體化合物［4］，提示著更多不可預測的風險。

現有的污染物分析方法利用液相色譜-質譜或氣相色譜-質譜聯用等技術僅針對已知目標化合物進行檢測，再基于濃度預測其毒性效應，但忽略了大量的非目標化合物或未知化學品，難以反映復雜體系中所有化合物的實際效應［5］。利用活體動物或離體細胞的生物效應檢測方法可以直接評估樣品的毒性，但較低的通量和較差的可重復性使得該方法無法適用于大規模樣品的篩選。為了運用更有效的方法預測化學品對人類健康及環境的影響，美國于2007年提出了Tox21計劃，美國環境保護署（EPA）、國家毒理學計劃（NTP）、國立衛生研究院（NIH）以及食品和藥物管理局（FDA）形成了Tox21聯盟，搭建了基于百余種離體細胞測試的高通量自動化毒性檢測平臺，建立了涵蓋工業化學品、消費品、食品添加劑等在內的上萬種化合物的毒性數據庫［6-7］。然而，Tox21篩選平臺僅限于純化學品的檢測，無法對未知化合物和實際環境樣品進行評價，不能反映復雜基質中化學品的實際毒性與健康危害。

面對我國嚴峻的環境與食品安全問題，為突破實際樣品中毒性物質快速識別的瓶頸，本課題組于2005年首次在國際上提出了“成組毒理學”（Integrated toxicology）的概念，并研制出第一代“成組毒理學分析儀”（Integrated toxicology analyzer，ITA），于2013年獲得國家發明專利授權［8］。該儀器通過固相萃取、高效液相色譜、四極桿串聯質譜、加樣裝置的在線聯用，可完成樣品自動分離、組分收集與分析、毒性測試三部分復雜的操作，適用于實際環境樣品中效應污染物的篩選。

近年來，隨著質譜技術、機械自動化、大數據分析及人工智能的高速發展，本課題組于2016年開始研制第三代成組毒理學分析儀—高通量多功能成組毒理學分析系統，從設備先進性、規模配置及功能設計等方面進行升級改造，旨在實現全面自動化、高通量的快速檢測與篩選，于2020年獲得國家發明專利授權［9］。該系統發展了自動化、高通量、簡便快捷的樣品分離與制備技術，構建了復雜介質樣品的分離與制備子系統，實現了復雜介質樣品中效應組分的自動提取、富集、純化、收集及規模化制備；發展了無機物、有機物、細顆粒物的分析與鑒定技術，構建了由質譜、光譜等儀器分析模塊與結構-性質關系信息庫組成的綜合鑒定系統，實現了復雜樣品中未知污染物、毒性效應物的自動多維分離、定量及鑒定；構建了以生物有效性、細胞生物學效應和生物靶分子3個層次的多靶點高通量毒性評價模塊，建立了污染物的內分泌干擾效應、神經毒理學效應、血液毒性效應等多靶點毒性評價方法，實現了樣品的高通量多靶點自動化毒性評價；發展了in silico污染物健康危害高通量篩查評價方法，實現了不良健康結局的優先級排序，為污染物健康影響評價提供理論和方法儲備，并建立了基于計算模擬的污染物體內潛在靶點篩查方法和計算模塊，整合于高通量成組毒理學數據一體化分析平臺。高通量多功能成組毒理學分析系統結合最先進的化學分析與現代毒理學評價方法，可高通量完成實際復雜樣品中效應污染物的結構解析、識別與毒性評價，顯著提高了污染物識別及毒性評價的可靠性及效率，為未知污染物的篩選及復合效應等研究提供了全新的技術手段和通用平臺。本文主要總結了成組毒理學分析儀的結構與設計，以及該儀器在復雜樣品中污染物分離與制備、污染物檢測與鑒定、生物毒性效應高通量篩查、實際樣品中效應污染物識別方面的應用進展，并對其未來的發展趨勢和應用前景進行了展望。

1 成組毒理學分析儀的結構與設計

第二代成組毒理學分析儀即高通量多功能成組毒理學分析系統涵蓋了多個功能區，包含復雜介質樣品的高通量分離與制備、有毒物質的儀器分析與結構-性質關系綜合鑒定、多靶點高通量生物效應評價、儀器控制及數據綜合分析4個子系統。通過各子系統功能間的耦合，可實現復雜介質樣品中效應組分的自動提取、富集、純化、收集及規模化制備，未知污染物的自動化多維分離、定量及定性分析，高通量多靶點自動化毒性檢測以及數據一體化解析。

復雜介質樣品高通量分離與制備子系統由樣品制備、樣品分離和樣品收集三部分組成，分別對樣品進行提取、凈化、濃縮，基于色譜柱的組分分離以及餾分自動化收集。該子系統主要原理涵蓋機械臂定位、進樣環定量、進樣閥切換、色譜分離及自動化軟件控制，樣品經自動化提取后，機械臂將樣品轉移至凈化濃縮模塊，凈化濃縮后的樣品直接經管道進入色譜分離系統進行組分的制備，通過進樣閥比例的調節，組分分別進入高分辨質譜完成污染物的鑒定，進入餾分收集系統完成組分的自動收集。有毒物質的儀器分析與結構-性質關系綜合鑒定子系統包括可用于有機物定量和定性分析的高分辨液相色譜-質譜、氣相色譜-質譜，以及自主研制的質子轉移反應質譜，用于無機物如金屬元素和甲基汞快速測定的檢測儀。經分離制備子系統處理得到的樣品或組分通過綜合鑒定子系統的相應檢測儀器完成測定后，結合測試結果并調用儀器控制及數據綜合分析子系統中的結構-性質關系信息庫模塊，完成污染物的快速鑒定。多靶點高通量生物效應評價子系統由生物有效性、細胞效應及分子效應檢測3個模塊組成，分別為通過檢測細胞生存力及跨膜電阻評價化合物穿透力的人Caco-2細胞的腸上皮生物屏障模型，通過檢測細胞增殖分化、凋亡、特征酶活性及受體轉錄活性的多種離體細胞高通量測試模型，以及通過檢測功能基因及蛋白的高通量DNA羥甲基化測序方法及DNA損傷產物的電化學發光檢測裝置。該子系統通過整合多種自動化細胞培養設備、全自動機械臂等，可高通量快速完成各模塊的全流程自動化測試。儀器控制及數據綜合分析子系統是以多維滑軌機械臂為核心的自動控制系統，通過建立化學品結構與性質關系數據管理體系、關鍵分子起始事件虛擬篩選技術及基于體外與生物信息學數據的有害結局通路解析方法，實現全流程數據采集、匯總與分析，通過結構與數據挖掘的信息和決策技術，完成數據一體化分析。

成組毒理學分析儀以自動化控制與高通量篩選為核心，形成了功能強大的有機整體，其主要工作流程如圖1所示。復雜樣品（如細顆粒物、土壤、底泥、藥物、生物樣品等）經前處理系統進行初步提取與凈化后，進行基于離體生物實驗的多靶點毒性效應快速篩查和基于靜電場軌道阱高分辨質譜的有毒物質快速鑒定，對于效應樣品進行進一步分離與純化，解析關鍵活性組分或未知化合物的結構特征。利用該系統，不僅可同時完成針對大規模樣品的化學分析與毒性檢測的聯動測試，也可進行單一化學分析或生物學效應高通量篩查，其作用和功能覆蓋了化學分析與毒理學研究中的多個層面。ITA可在短時間內獲取化合物的毒性、含量及結構特征，為環境化學與毒理學研究領域提供了強有力的技術手段和通用平臺，可滿足我國環境保護、食品安全、藥物成分解析、軍事毒物分析等應急需求。

圖1 成組毒理學分析儀工作流程Fig．1 The workflow of integrated toxicology analyzer

2 污染物識別與毒性測試方法的開發與應用

2.1 在復雜樣品中污染物分離與制備方面的應用

環境、食品和生物樣品中污染物種類繁多、性質各異，一些有機污染物的濃度很低，因此建立復雜樣品中不同污染物的快速提取、凈化、分離方法對實現大量樣品的高通量分析與檢測極為重要。已有的樣品前處理及制備技術僅利用獨立的儀器或容器進行樣品中特定性質污染物的處理，操作復雜、耗時長、重復性差，且無法進行痕量物質的高效提取［5］。ITA中高通量分離與制備系統解決了復雜介質樣品提取與制備的難題，利用該系統，通過樣品分級提取、組分收集、色譜分離純化及細顆粒物分離純化，即可完成不同樣品的快速提取與組分的制備。

ITA整合了加速溶劑萃取儀、全能樣品前處理平臺、機械臂等自動化設備，通過硬件連接和軟件控制結合的方式，開發了適用于復雜樣品中目標有機污染物的自動化提取與制備技術。對于固體、半固體樣品的處理，采用快速溶劑萃取儀完成對污染物的提取。全能樣品前處理平臺集成了凝膠凈化、固相萃取、定量濃縮和液相進樣4個功能模塊，可獨立完成液體樣品中有機物的提取、富集和濃縮。完成提取、凈化及濃縮的樣品，經色譜柱分離后，分別進入質譜儀及收集器，可快速用于后續各餾分化學檢測與生物效應評價的并行分析，節省了樣品處理時間并提高了效率。

細顆粒物樣品不僅附著了各類金屬、有機物，且一些超細顆粒物可進入人體從而產生健康危害，針對細顆粒物樣品的分離純化是深入研究其環境效應及生物安全性的前提。在ITA系統中，中科院生態環境研究中心的譚志強等［10］利用中空纖維膜流場流分離技術自主研制了細顆粒物的在線多維分離純化模塊，通過與紫外吸收光譜檢測器和電感耦合等離子發射光譜的在線聯用，可進行不溶態顆粒粒徑表征及顆粒上附著的可溶性金屬的定量測定。利用該裝置，針對在超純水、模擬天然水和模擬肺液中孵育的實際大氣細顆粒物樣品，進行可溶性金屬及殘余細顆粒物的分離純化，并對其溶出率及數量進行測定，發現鋅在模擬肺液中的溶出率最高，而尺寸小于10 nm的細顆粒物在模擬肺液中檢出的數量最多。該裝置可快速有效地分離純化可溶性金屬組分及小粒徑的細顆粒物，在實時監測并追蹤大氣細顆粒物在環境與生物介質中的轉化方面具有潛在的應用前景。

2.2 在污染物檢測與鑒定方面的應用

復雜樣品中未知污染物的結構鑒定往往需借助多種儀器和技術完成，對于未知化合物，除了質譜分析結果，還需利用紫外、紅外等多種光譜技術以及核磁共振波譜技術分別對餾分中化合物的官能團以及分子骨架進行分析，以推測結構。ITA整合了超高分辨率、超高質量準確度的全掃描型高分辨質譜儀，輔以光譜分析模塊，結合數據分析軟件，可實現樣品或組分中新型未知污染物的高通量快速識別。

在新污染物鑒定方面，本課題組阮挺等［11］對20個省份和自治區共56個不同污水處理廠的污泥樣本中新型氯代多氟醚基磺酸鹽類物質（Cl-PFESAs）進行疑似靶標篩查，發現了3種Cl-PFESAs同系物，即6∶2 Cl-PFESA、8∶2 Cl-PFESA和10∶2 Cl-PFESA，其檢出率分別為100%、89．3%、23．2%，污泥中化合物含量范圍為未檢出~209 ng/g（干重）。其中6∶2 Cl-PFESA為最主要的Cl-PFESAs污染物，其幾何平均濃度為2．15 ng/g，在部分地區污泥樣本中的濃度已超過全氟辛烷磺酸鹽（PFOS），成為主要的全氟化合物污染物。進而對6∶2 Cl-PFESA在體外超還原態氰鈷胺厭氧體系中可能的轉化產物進行非靶標分析，篩查出3個脫鹵加氫還原轉化產物，即1H-6∶2 PFESA、2H-6∶2 PFESA和1H-6∶2 PFUESA，進一步在真實河流底泥樣品中發現了其轉化產物［12］。在污染物轉化方面，本課題組張青等［13］采用2，4，6-三溴苯酚對水稻進行了水培暴露，通過可能的代謝途徑建立本地的代謝物數據庫，結合氣相色譜和高效液相色譜-高分辨質譜，鑒定了40種Ⅰ相和Ⅱ相代謝物，為系統了解溴苯酚的遷移轉化及其環境健康風險評估提供了重要參考。同時，本課題組陳偉芳等［14］利用基于成對質譜碎片質量差的方法，在水稻細胞中鑒定出65種新型短鏈和中鏈氯化石蠟代謝物，并揭示了其在懸浮水稻細胞中的代謝分子網絡，首次發現了氯化石蠟的羥基化、硫化和糖基化過程。

在有機氣體檢測方法方面，中科院生態環境研究中心束繼年課題組［15］通過單光子過程研究、質子來源研究、激發態二氯甲烷誘導的高效質子化過程機理推導，揭示了激發態二氯甲烷誘導的質子轉移離子化機理，以此研制了新型電離方法。基于研制的新型離子源，研究人員開展了常見爆炸物如硝基化合物的高靈敏檢測研究［16］，該方法對芳香族硝基化合物具有超高的電離效率，對空氣中硝基苯化合物的檢測具有重要應用價值。利用新離子化技術，可在呼出氣體中檢測疾病相關的生物標志物如丙烯醛等［17］，實時監測有機胺類物質［18］，檢測有機磷類神經毒劑等［19］。該方法應用范圍廣，實用性強，有望為各類復雜樣品中揮發性有機物化學成分的鑒別及含量測定提供技術支撐。

2.3 在生物毒性效應高通量篩查方面的應用

復雜介質樣品中存在多種化合物，其毒性效應各異，在機體內的代謝及生物有效性尚不明確，而針對其中種類繁多的未知污染物的毒性篩選工作相當繁重，時間、人力、財力消耗巨大。然而，目前國際上現有的毒理效應篩選平臺僅限于純化學品的檢測，且在效應重組細胞及分子傳感器上存在缺陷，無法進行復雜基質及未知化合物的高通量篩選與毒性評估。ITA中多靶點高通量生物效應評價子系統是以離體生物學測試為核心的自動化毒性測試模塊，適用于樣品、組分或化學純品的各類毒性效應高通量篩查研究。

四溴雙酚A（TBBPA）及其衍生物是一類新型溴代阻燃劑，廣泛用于電子電器產品、油漆、紡織品等日用品。這類物質的大量使用，不可避免地使其隨著人們的生產生活進入到環境中，對人類造成威脅。本課題組曲廣波等［20］利用ITA平臺中多靶點毒性篩查技術，基于T-screen方法研究了TBBPA衍生物及其環境轉化產物對TR信號通路的潛在干擾效應，結果表明，這些化合物可能會與甲狀腺激素轉運蛋白結合從而干擾甲狀腺激素水平，也可能會進入細胞與甲狀腺激素受體TR作用，干擾相關基因調控從而引起甲狀腺激素干擾效應。與TBBPA衍生物相比，其環境轉化產物更易進入細胞而發揮甲狀腺激素干擾作用。該研究可為TBBPA衍生物及其環境轉化產物的健康風險評估提供科學依據，也提示人們其環境轉化產物可能帶來的潛在威脅。

由新冠病毒SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）已遍及全球，越來越多的研究關注其感染的相關因素。血管緊張素轉化酶2（ACE2）被確定為SARS-CoV-2的功能受體，其轉錄水平與SARS-CoV-2易感性和COVID-19癥狀的嚴重程度呈正相關。ACE2轉錄水平受遺傳因素和非遺傳因素的調控，作為非遺傳因素的外源化學品暴露對病毒受體的表達影響尚不明確。利用ITA平臺，本課題組曲廣波等［21］基于多種細胞系建立了病毒受體轉錄表達的高通量檢測方法，針對環境中常見的60種化學污染物進行篩選，發現部分污染物如鉛以及大氣細顆粒會導致ACE2轉錄水平顯著上調（如圖2所示），最高表達量可達到對照組的7倍。該研究揭示了外源性化合物暴露可能通過共同的關鍵調控因子影響病毒受體的轉錄，從而增加病毒感染的可能性，為研究外源化合物暴露與病毒易感性和有害結局路徑之間的聯系提供了初步線索。

圖2 不同化學品暴露對病毒受體轉錄水平的影響［18］Fig．2 Expressions of virus receptors in HEK-293T cells stimulated by nongenetic external chemicals［18］

2.4 在實際樣品中效應物質識別方面的應用

識別實際樣品中的效應物質是污染物環境風險評估及污染物控制的重要步驟，單一的化學分析或毒性測試難以反映實際樣品的效應。效應導向分析（Effect-directed analysis，EDA）是以生物效應為核心，通過組分分離及化學分析實現復雜環境樣品中貢獻污染物的有效識別方法［22-23］。該方法從樣品的生物效應入手，僅針對活性樣品進行組分分離及結構鑒定，很大程度上降低了樣品的復雜性并縮小了篩選范圍，可直接快速地鎖定毒性貢獻化合物［24-25］。

利用EDA思路，基于第一代ITA系統，本課題組［26］建立了基于大鼠小腦顆粒神經元細胞（CGNs）原代培養方法，通過毒物或樣品對CGNs暴露進行毒性評價，建立了神經毒性效應引導的復合污染物毒性篩查新方法，進而應用非靶標有機質譜技術，對某化工廠附近的實際環境樣品進行測定，在活性組分中鑒定出1種潛在的新型有機污染物—四溴雙酚A雙丙烯基醚（TBBPA-BAE）。基于TBBPA-BAE的毒性當量和化學濃度，發現其在樣品中的濃度可以解釋實測發育神經毒性的86%，表明該物質是誘發潛在神經毒性風險的主要效應污染物。該研究為實際樣品中效應物質的識別奠定了堅實的理論和技術基礎。

基于ITA平臺，本課題組［27］進一步利用EDA技術對廣東貴嶼地區電子垃圾拆解地附近底泥中的雌激素效應污染物進行了篩查。通過體外MVLN細胞熒光素酶報告基因體系對樣品進行雌激素效應初篩，針對效應樣品，利用反相制備色譜進行組分的分離與制備，對所有組分進行雌激素效應檢測后篩選出活性組分，通過高分辨質譜靶向和非靶向結構識別，發現了雙酚A、己烯雌酚等7種物質為雌激素效應貢獻物，并對其污染來源及遷移規律進行了解析。同時，本課題組［28］使用效應導向分析策略鑒定了樣品中的多環芳烴受體激動劑，選取小鼠肝癌細胞系CBG2．8D報告基因檢測法用于毒性的定量及毒性效力的測定，采用正相制備色譜對效應樣品進行組分分離，以降低樣品中化合物的復雜程度。借助氣相色譜-高分辨質譜技術，結合毒理學數據庫比對，篩選并最終確定23種化學物質為樣品中的多環芳烴受體激動劑，其中二至五環的多環芳烴化合物是樣品中毒性效應的主要來源。上述兩項研究均通過效應導向分析策略揭示了電子垃圾拆解地區相關的毒性效應因果化學物質，為特征污染地區效應化學品的監控提供了重要的科學數據和應用參考。

2.5 在環境分析與毒性檢測產業化及合作研究方面的應用

基于成組毒理學分析儀的概念，本課題組提出了集約型自動化小型機的創新思路與技術設計，擬研制不同樣品的特異毒性化學物質篩選與識別個性化系統，面向環境保護及監測、食品安全、軍事毒物分析等領域的不同檢測需求，實現該小型化系統的個性化定制并積極推動其產業化應用。利用ITA系統，本課題組在樣品檢測與應用方面與各研究機構或企業合作開展了樣品中有毒物質識別及特定毒性測試技術開發等研究，例如，與國內知名企業合作開展了產品中毒性化學品的篩查與識別研究，與軍事醫學研究機構合作開展有毒化學品的風險快速評估等工作。成組毒理學分析平臺可用于各類環境風險、污染物篩選識別、食品安全、生物樣品、中藥試劑、化學品評估等復雜樣品的聯合研究。

3 總結與展望

成組毒理學分析儀是國際上首臺可用于實際樣品分析測試與毒性篩查的綜合平臺，可自動化完成樣品前處理、組分分離與制備、多靶點毒性測試及效應物質結構識別與鑒定，顯著提高了污染物識別及毒性評價的可靠性和效率，將大大推動我國環境科學與毒理健康基礎研究的水平。為發揮其優勢，展現其在環境與健康研究、食品安全、軍事及國家安全等領域的巨大應用潛能，將從以下方面進行改進并推動其應用：

（1）特異響應細胞的構建及類器官毒性測試模型的建立。利用報告基因生物檢測技術或基因編輯技術，針對毒理學研究新興領域，構建化合物特異效應檢測細胞株和類器官毒性評價模型，并運用于高通量自動化檢測平臺，為快速篩查復雜樣品中健康風險物質提供有效的生物效應測試手段。

（2）新污染物篩查方法的開發及數據庫的建立。結合多種質譜技術，發展適用于不同化合物類型的高靈敏識別與鑒定方法，以提高污染物發現效率。基于新污染物的特征質譜信息，建立標準化污染物指紋數據庫，以適用于我國新型污染物的篩查研究。

（3）篩選通量的拓展及靈敏度的提高。基于已建立或正在開發的樣品分離與制備及毒性測試方法，拓展制備及測試通量，實現384或1 536微孔板的快速高通量測試。在拓展通量的同時，通過改進優化關鍵技術，提高毒性篩選的靈敏度，以適用于復雜介質中低劑量有毒物質的毒性效應檢測。

（4）全流程標準化方法的建立及產業化應用。根據國家標準及測試法規，建立樣品全流程自動化提取、制備、毒性測試及結構鑒定的標準化方法，并獲得國家級認證資質，以應用于工業化學品、中藥或合成藥物、食品、軍事毒物、突發事件毒物檢測等領域，建立成高效快速的測試平臺。