食源性致病菌快檢技術研究進展及應用現狀分析

張士財，丁衛平

（濱州市檢驗檢測中心，山東 濱州 256603）

食源性致病菌依然是引起人類食源性疾病的主要原因[1]。根據世界衛生組織2021年的報告，每年約有6 億食源性疾病病例，即使是一些發達國家，如美國，每年也有1/4 的人罹患食源性疾病[2-3]。近幾年，我國不斷加大食品安全抽檢力度，由國家市場監督管理總局公布的食品安全監督抽檢結果數據可以看出微生物超標占檢測不合格項目的比例呈逐年下降趨勢（2019年占比28.4%，2020年占比23.03%，2021年占比22.40%）[4-5]，但仍然占較高比例，是威脅食品安全的主要因素之一。隨著我國對食品安全重視程度的提升以及科學技術的發展，食源性致病菌快速檢測（以下簡稱快檢）技術迅猛發展，以免疫標記技術、核酸擴增技術、生物傳感器技術等為基礎的快檢技術成為食源性致病菌檢測的主流，每種技術原理不同，但相較于傳統技術，因具有高效、快速、特異的優勢而成為研究熱點。

1 免疫標記技術

免疫標記技術指利用免疫分子抗原和抗體特異結合的原理，并用熒光素、酶、膠體金等標記物對免疫分子進行標記，通過檢測標記物相關信號指標，以實現對特定抗原抗體的定性或定量檢測。

1.1 免疫酶技術

免疫酶技術即以酶作為標記物，待測組分與相應的抗原或抗體作用后，酶得以催化底物而發生顏色反應，通過顏色變化而對待測物作定性和定量分析[6]。應用最廣的是酶聯免疫吸附實驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA），其抗原抗體特異性結合反應在固相載體上進行，實驗步驟和操作過程更加簡便。ELISA 又包括雙抗體夾心法、間接法、競爭法、生物素-親和素法。向雙林等[7]利用雜交瘤技術制備了高純度的單克隆抗體6A6、2A2，并建立了具有良好敏感性的雙抗夾心ELISA 檢測方法檢測阪崎腸桿菌，其檢測限達1.0×103CFU·mL-1，與其他數種食源性致病菌無交叉效應。

1.2 免疫熒光技術

免疫熒光技術即以熒光素作為標記物，與特異抗體或抗原結合后產生熒光，通過熒光顯微鏡監測熒光反應來檢測目標致病菌的一種方法。目前研究較多的熒光素有免疫熒光微球和量子點。梁珊[8]利用免疫磁珠技術和免疫熒光技術相結合的方式，對痕量的李斯特菌進行特異性檢測，將具有長波熒光發射的CdZnTe 量子點標記檢測抗體作為特異性信號指示劑，其檢測方法具有1 ～109CFU·mL-1的寬檢測范圍和1 CFU·mL-1的低檢測限，實現了對李斯特菌異常靈敏的檢測。

1.3 免疫膠體金技術

免疫膠體金技術在食源性致病菌檢測中應用最多的是膠體金免疫層析技術，是以膠體金作為標記物標記抗體，將需要的抗原或抗體固定在硝酸纖維素膜（NC 膜）上，待測樣品添加到樣本墊上，通過層析作用在NC 膜上向一側遷移，待檢物先與金標抗體形成結合物，再遷移至固定的抗原或抗體的區域，發生特異性結合而聚集并顯示出膠體金的橘紅色或紫紅色，肉眼觀察即可判斷待測組分的有無[9]。山珊等[10]首先用免疫磁珠對目標菌進行富集，再利用膠體金標記抗體并同時偶聯β-內酰胺酶，當目標菌存在時，β-內酰胺酶高效地水解青霉素，再將水解液滴加到免疫層析紙條上，通過間接檢測青霉素而使轉導信號放大，從而實現了對大腸桿菌O157 ∶H7的特異性檢測，最低檢出限為2×102CFU·mL-1，極大提高了此方法的檢測靈敏度。

免疫標記技術基于免疫分子抗原抗體特異性結合的原理，提高了致病菌檢測的特異性，但也有一定局限性，如酶標記物需要有一定的純度和活度，熒光標記物則需要較高的熒光效率。此方法整個過程步驟較多，受固相載體、抗原、受檢樣品、洗滌劑、稀釋劑、作用時間以及檢測儀器等因素影響，往往導致結果偏差。同時，抗原抗體高度特異性結合，而食源性致病菌種類繁多，往往一個檢測試劑盒只能檢測一種抗原，也造成了檢測通量低的問題。

2 核酸擴增技術

核酸擴增技術以核酸為基礎，在酶的作用下通過變性、退火、延伸重復循環過程實現核酸的體外復制擴增，進而達到檢測目標致病菌DNA 或RNA 的目的[11]。近幾十年，在普通聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）基礎上衍生出多種技術，用于食源性致病菌檢測的方法主要有多重聚合酶鏈式反應、熒光定量聚合酶鏈反應、數字聚合酶鏈反應以及等溫擴增技術。

2.1 多重聚合酶鏈式反應

多重PCR 是在普通PCR 基礎上，在一個反應體系內加入多種特異性引物而同時對多個模板進行擴增的方法。其能夠進行多種致病菌檢測，提高了檢測通量，縮短了檢測時間[12]。張明娟等[13]通過優化引物設計、反應體系、反應條件建立了一個在PCR反應體系中同時檢測單增細胞增生李斯特菌等10 種食源性致病菌的多重PCR 檢測方法，在人工污染樣品評價中，結果顯示出此體系特異性強，靈敏度高，10 種致病菌檢出限均可達10 CFU·mL-1。

2.2 熒光定量聚合酶鏈式反應

熒光定量PCR 是在PCR 反應體系中加入熒光標記的探針（常用TaqMan 探針）或者熒光染料（常用SYBR Green 染料），通過儀器來監測PCR 反應過程中熒光信號的積累，最后分析CT 值或者建立標準曲線來實現對待測成分定性定量分析的技術。董瑞等[14]以金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌為測試對象，設計特異引物和探針，并與GB 4789 系列標準方法進行比較，檢測結果與國標一致，并能大大縮短檢測時間。

2.3 數字聚合酶鏈式反應

數字PCR 是在熒光定量PCR 的基礎上，將反應體系分布到芯片微孔中實現微滴化，理想狀態下每個微孔中最多只有一個核酸拷貝，通過儀器對熒光信號進行泊松分布統計分析，進而實現對初始樣本中核酸拷貝的含量測定。張明明等[15]在單重數字PCR 基礎上建立了檢測傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及單核細胞增生李斯特氏菌的三重數字PCR體系，結果顯示線性相關性和重復性較好，最低檢 出 限 分 別 為0.23 copies·μL-1、0.18 copies·μL-1、 0.42 copies·μL-1。

2.4 等溫擴增技術

等溫擴增技術即在同一恒定溫度下，對靶序列進行特異性擴增，使其產生大量拷貝以達到檢測水平的體外擴增技術。食源性致病菌常用的等溫擴增技術主要有環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）、 重 組 酶 介 導核 酸 擴 增 技 術（Recombinase Aided Amplification，RAA）、重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）等。

LAMP 是指在60 ～65 ℃的恒定溫度，鏈置換DNA 聚合酶作用下，使用4 種不同的引物來擴增靶基因上的6個不同區域，進行體外核酸擴增的技術[16]。XU 等[17]開發了一種簡單、靈敏、特異性和可視化LAMP 方法來檢測霍亂弧菌毒力相關和物種特異性基因，在可見光下發生顏色變化（從橙色到淺綠色），通過肉眼即可讀取陽性結果，可用于快速篩選各種來源的水和常用的魚類樣本中的霍亂弧菌。RAA 與RPA 原理相似，皆是在等溫條件下（最適溫度37 ℃）通過重組酶、重組酶加載因子和單鏈結合蛋白與引物和靶序列的相互作用，完成核酸靶序列的體外擴增的技術，不同點是兩者重組酶來源不同[18-20]。姚麗鋒等[21]建立了銅綠假單胞菌lasB 基因RAA 檢測方法，人工污染實驗評價特異性良好，對其他致病菌無交叉反應，檢測時間僅需20 min，對純菌液的檢測靈敏度達到了1.7 pg·μL-1。

核酸擴增技術以其高靈敏度，高特異性等優勢，被廣泛應用于食源性致病菌檢測[22]。多重PCR 能夠實現幾種甚至十幾種致病菌同時檢測，相比于熒光定量PCR，多重PCR 不需要合成價格較貴的探針，所需儀器及試劑費用較低，但是其局限在需要設計多對特異性引物以防止同一體系出現非特異性擴增，同時需要結合下游的凝膠電泳成像技術才能得到檢測結果。熒光定量PCR 相較于多重PCR 引入探針使擴增特異性更強，靈敏度更高，儀器監測熒光信號過程結束即可分析得到檢測結果，更加便捷快速，可進行定性和相對定量分析，但由于熒光檢測通道限制，很難實現高通量檢測，而且探針合成和儀器費用較高，提高了檢測成本，在檢測樣本低拷貝以及存在抑制劑時容易出現假陰性等現象。數字PCR 相較于熒光定量PCR，具有高靈敏度、高精確度、對抑制劑高耐受性和絕對定量等優點[23-24]，但與熒光定量PCR 類似具有試劑儀器費用成本高等局限。LAMP、RAA、RPA 等溫擴增技術檢測效率高，實用價值強，只需要在等溫條件下，幾十分鐘即可實現產物大量擴增。由于其所需設備簡單，環境條件要求低，非常適合在基層食品安全監測的應用，目前我國已經出臺多個LAMP 檢測行業標準[25-26]。LAMP 同樣也存在著明顯的缺點，其只適用于擴增較短片段，并且引物設計相較于傳統PCR 方法難度大，因引物多、溫度低導致其擴增產物組成較復雜，特異性難以驗證，反應體系極易受到污染[27-28]。

核酸擴增技術在靈敏度、特異性、定量檢測等方面較傳統檢測技術有無可比擬的優勢，但其以致病菌核酸為檢測對象，無法分辨死活細胞而出現假陽性，因此需要結合其他檢測技術進行相互確證。

3 其他快檢技術

除了基于免疫學原理和核酸擴增原理的快檢技術外，在食源性致病菌檢測中研究較多的還有生物傳感器技術、質譜技術、生物芯片技術和光譜技術等。生物傳感器是對生物分子（如酶、抗體、抗原、核酸等）進行設計或者修飾，使其能與待測物發生反應從而產生濃度信號，經過物理或化學等技術進行信號轉換，最終輸出為可供檢測的電信號，再經過系統分析處理便可得到實驗數據，在致病菌檢測中應用最多的是電化學生物傳感器和光化學生物傳感器[29]。質譜技術在致病菌檢測研究最多的是基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜，其原理是基于不同致病菌帶有不同的核糖體蛋白質，在與基質溶液反應后，在激光輻射下樣品發生電離，經過飛行時間檢測器，不同質荷比的離子分開，形成細菌特異性的質譜圖，與已有數據庫進行比對來確定細菌的種屬[30]。生物芯片是將靶標基因的特異性序列作為探針固定在玻璃芯片、硅芯片或尼龍膜等載體上，然后與標記的待測靶標基因按堿基配對原理雜交，經放射自顯影、激光共聚焦熒光檢測或酶-底物顯色系統等處理芯片，得到特定信號來判定是否存在目標菌[31]。光譜技術是基于物質與電磁輻射作用，物質內部發生量子化的能級躍遷而產生發射、吸收或散射輻射等現象，通過對特定波長和強度進行分析來檢測待測物的一種技術，研究較多的如近紅外光譜和表面增強拉曼光譜[32]。

4 快檢技術在基層食源性致病菌監測中應用現狀及建議

快檢技術種類繁多，在基層的應用主要集中在食用農產品農藥殘留和獸藥殘留的監測領域，對于食源性致病菌的檢測應用較少[33-34]。目前快檢技術已有部分國家標準，并已有部分地區配備了基于LAMP 的快檢儀器，但在食源性致病菌檢測結果方面不盡人意[35]。大多數快檢技術仍然處于實驗室研究階段，為加快快檢技術基層落地發揮其優勢，提升基層食品安全監測水平，提出以下幾方面建議。

4.1 加快完善標準體系，為快檢提供標準支撐

由于快檢技術種類繁多，多種技術融合發展，盡管一些快檢技術已有行業標準，但檢驗標準涉及面較小，同時快檢技術所需試劑、儀器設備等缺少相應的計量和檢定標準，大大影響了快檢技術的準確性，應加快快檢方法的標準認定，拓展檢測范圍，為快檢技術基層落地提供法規依據。

4.2 加快產品研發，提高產品質量

成本投入高是限制快檢技術在基層應用的重要因素之一。雖然快檢技術多種多樣，但大多數技術只是在高校、研究院及大型實驗室進行，試劑耗材成本較高，儀器設備價格昂貴，如數字PCR 儀器、質譜儀等，基層生產企業、檢測站等機構無法承擔。目前雖有便攜化快檢儀器，但種類較少，試劑質量穩定性差，成本較高。因此，我國應加快快檢商品化試劑和便攜儀器的研發，提高產品質量，開拓快檢市場。

4.3 加強人員培訓，提高檢測水平

當前快檢儀器和試劑生產、研發和應用的專業人員不足，基層檢測室檢測人員往往是兼職從事檢測工作，一些基層雖然配備了快檢儀器，但是人員專業能力不強，出現檢測問題無法解決，應加強基層專業技術人員培訓，組織能力驗證，提升基層人員檢測水平。

4.4 建立快檢一體化平臺，實現數據共享

基層食品安全工作以及食品生產企業面臨不少困難，很難在食品安全監測工作上加大投入。因此，可以加強市縣兩級聯動，建立食源性致病菌監測一體化的快檢平臺，通過人員共享、儀器共享、數據共享等實現快檢技術在基層落地。

5 結語

微生物污染在食品監督抽檢不合格項目中占比較大，仍然需要加大對食品微生物指標的監測力度。近幾年，以免疫學、分子生物學、蛋白質組學、光譜學以及質譜學等原理為基礎的現代檢測技術不斷發展。相比傳統技術，快檢技術在特異性、靈敏度、檢測效率等方面具有巨大優勢，為食源性致病菌快檢技術的發展和應用提供了機遇。當前，由于受微生物本身特點影響，原始樣本中的菌體載量較低，需要培養富集是限制檢測速度的關鍵因素，快檢技術在縮短富集時間方面仍然需要進一步探索。免疫磁珠分離技術的應用減少了檢測時間，但免疫磁珠富集利用抗原抗體特異結合原理，往往只對一種致病菌發揮作用，很難實現高通量操作，商品化試劑盒的種類較多，靈敏度穩定性方面良莠不齊[36-37]。雖然這些現代化技術或多或少都存在不足之處，如試驗成本高、操作技術要求高、方法不成熟等問題，但隨著多學科、多種技術結合等新技術的研發，快檢技術必將朝著更高效、更靈敏、更準確以及更便捷的方向發展，為食品安全監管提供技術支撐。