慢性應激對大鼠認知及小膠質細胞Aβ沉積的影響*

呂霞劉歡12

應激是由社會環境因素引起的非特異性和適應性反應。適當的應激有利于維持機體的穩態，增強機體對不利環境的適應力。然而，長時間應激會使機體生理系統和器官發生改變，導致應激損傷，對機體健康產生有害影響[1]。大腦是應激反應的敏感靶器官，長期應激刺激會改變大腦的結構，擾亂下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)，導致神經元的丟失，海馬體的萎縮，進而使認知能力下降[2～4]。流行病學研究發現長期處于應激狀態下的人群輕度認知障礙和癡呆癥的患病率較同齡非應激狀態人群高2倍以上[5]。腦組織內β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積是導致認知功能下降的重要原因之一，慢性應激可升高糖皮質激素水平，促進Aβ沉積[6]，也可通過下調胱硫氨酸β合酶的水平從而升高同型半胱氨酸的濃度，使大腦對β-淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)處理發生錯誤，增加Aβ沉積，降低認知功能[7，8]。

小膠質細胞是中樞神經系統的主要免疫細胞，占神經細胞總數的5%～10%，靜息狀態下的小膠質細胞可在Aβ沉積物周圍形成一個保護性屏障，抑制Aβ的擴散，也可吸收和清除可溶性Aβ，防止Aβ的聚集[9]。然而，活化的小膠質細胞可通過信號分子，促進Aβ的產生，也可抑制補體激活途徑，降低其吞噬降解Aβ的能力[10]。活化的小膠質細胞表達高水平的晚期糖基化受體(Receptor of Advanced Glycation Endproducts，RAGE)、清道夫受體(Scavenger Receptor，SR)和Toll樣受體(Toll-Like Recepetor，TLR)、髓樣細胞觸發受體2(TREM2)，促進Aβ進入小膠質細胞[11，12]，積累的Aβ可通過一系列反應損傷神經元，導致認知能力減退[13]。近來對癡呆患者和動物模型的研究發現[14，15]，Aβ沉積部位存在著活化的小膠質細胞，這些發現進一步說明了活化的小膠質細胞可能對Aβ沉積和認知能力的減退有影響。 本研究擬探討慢性應激是否可影響小膠質細胞功能和Aβ沉積，為探索慢性應激影響認知功能的機制提供線索。

1 對象與方法

1.1 對象 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠16只，體質量(180±20) g，購買于北京斯貝福生物科技有限公司，隨機分為模型組和對照組，每組8只。動物飼養在溫度為(25±1) ℃，濕度為70%±2%，12 h晝夜循環的環境中。適應性喂養1周后，進行慢性不可預知性刺激(CUMS)造模。

1.2 方法

1.2.1 CUMS模型建立 參考文獻采用CUMS方法制備動物模型[6]， 每天從9種應激方式(夾尾2 min、墊料潮濕8 h、晝夜顛倒24 h、搖晃鼠籠15 min、束縛2 h、禁食24 h、禁水24 h、60 Hz噪聲1 h、4 ℃冰水游泳5～10 min)中隨機選擇2種，給予大鼠；為避免大鼠對應激方式產生適應性，3 d內不重復采用相同的刺激方式，持續12周。

1.2.2 曠場實驗(Open-filed test) 使用曠場實驗來評估大鼠的運動能力和認知功能。實驗開始時將大鼠放置于62.5× 74.0× 51.0 cm的黑盒中，自由運動，記錄5 min內大鼠的運動距離和靜止時間。實驗結束后，用75%的酒精擦拭儀器。

1.2.3 高架十字迷宮實驗(Elevated-plus maze) 高架十字迷宮由兩個開臂(50×10 cm, L×W)和兩個閉臂(50×10×40 cm, L×W×H)組成，形狀如同一個十字。實驗開始時，將每只大鼠放于中央，自由運動5 min，記錄其運動的距離和靜止的時間。實驗結束后用75%的酒精擦拭儀器。

1.2.4 取材 行為學檢測結束后，采用水合氯醛(0.3 ml /100 g)麻醉，斷頭取出完整的大腦組織，浸沒于4%中性多聚甲醛固定并過夜，梯度脫水，石蠟包埋，沿大腦組織冠狀面進行切片，切片厚度約為3～4 μm，包括皮質和海馬區等。

1.2.5 酶聯免疫吸附法(ELISA) 測定腦組織內的Aβ1-40和Aβ1-42使用大鼠Aβ1-40和Aβ1-42的ELISA試劑盒，根據說明書的方法和操作步驟進行操作，將腦組織與PBS緩沖液按1∶9的比例稀釋，裂解組織后，4 ℃離心15 min后取上清液，測量腦組織勻漿中Aβ1-40和Aβ1-42的濃度。使用BCA蛋白定量試劑盒測定腦組織勻漿上清液的總蛋白量。最后根據蛋白定量的濃度，換算腦組織內Aβ的含量。

1.2.6 免疫熒光(immunofluorescence) 腦組織石蠟切片脫蠟后，與原代多克隆鼠抗Iba-1(1∶100)，兔抗Aβ1-40(1∶100)，兔抗Aβ1-42(1∶100)，兔抗TLR4(1∶100)，兔抗RAGE(1∶100)4 ℃孵育12～16 h，然后與熒光偶聯二抗(山羊抗兔，1∶1 000或山羊抗鼠1∶10 000)常溫孵育1 h后，最后加入4’，6-二氨基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)封片，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 統計學方法 實驗數據使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 5.0進行分析。所有數據均采用獨立樣本t檢驗進行分析，數據均表示為均數±標準差，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CUMS對大鼠認知能力的影響 與對照組比較，模型組曠場實驗和高架十字迷宮實驗中的靜止時間增加(P<0.01)，運動距離縮短(P<0.05)。見表1。

表1 兩組認知能力比較

2.2 CUMS對大鼠腦內Aβ的影響 與對照組比較，模型組大鼠腦內Aβ1-40和Aβ1-42水平均升高(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠腦內Aβ水平比較

2.3 CUMS對小膠質細胞的激活和小膠質細胞內Aβ含量的影響 與對照組比較，模型組大鼠海馬區和皮質區活化的小膠質細胞的數量增加(P<0.05)；模型組大鼠海馬區和皮質區中小膠質細胞內的Aβ1-40和Aβ1-42增加(P<0.05)。見表3，表4，圖1。

表3 CUMS對小膠質細胞激活的影響

表4 兩組小膠質細胞內Aβ含量比較

2.4 CUMS對小膠質細胞Aβ吞噬受體RAGE和TLR4表達的影響 與對照組比較，模型組海馬和皮質區內的小膠質細胞內TLR4和RAGE表達增加(P<0.05)。見表5，圖2。

表5 兩組小膠質細胞Aβ吞噬受體RAGE和TLR4表達比較

注：海馬冠狀切片圖標尺=50 μm(200×)

注：海馬冠狀切片圖標尺=50 μm(200×)

3 討論

慢性應激是認知能力下降和癡呆發生的強危險因素，會增加癡呆的發病率，提前癡呆的發病年齡[16]。本研究使用曠場實驗和高架十字迷宮兩種方式驗證慢性應激對動物認知功能的影響，結果均顯示其探索能力和認知運動能力降低，提示慢性應激可誘導大鼠出現認知能力的下降。

本研究發現，模型組大鼠腦內Aβ含量增加，海馬區與皮質均有沉積。Aβ主要以Aβ1-40和Aβ1-42的形式存在于腦內，其中 Aβ1-40作為主要的可溶性Aβ形式，其數量較Aβ1-42多，但Aβ1-42更易纖維化聚集成斑塊，具有較強的神經毒性[17，18]。本研究發現腦內Aβ1-42的濃度比Aβ1-40低，與以上研究一致。生理情況下Aβ的生成和降解處于動態平衡，使Aβ1-40和Aβ1-42維持在較低水平[19]。有研究發現6周CUMS刺激導致大鼠腦內Aβ的輕微增加[8]。更有研究顯示慢性應激刺激可導致APP裂解酶的活性異常增高，小膠質細胞吞噬清除Aβ的能力受損，腦內Aβ異常沉積，可導致認知功能障礙發生[20]。海馬和皮質是調控記憶力和認知功能的主要腦區，當海馬和皮質區內Aβ含量升高時，尤其Aβ1-42的濃度增加時，可促進老年斑塊的形成，減退認知功能[21]。本研究使用12周CUMS刺激，造成慢性應激，發現大鼠腦組織皮質及海馬區內Aβ1-40和Aβ1-42含量均增加，認知運動功能下降。以上現象可能與，在CUMS造模下，大鼠腦組織內Aβ不斷累積，進一步誘導下游的級聯反應，減退認知能力有關[21]。

小膠質細胞是中樞神經系統的主要免疫細胞，介導炎癥反應，參與神經元的正常連接，調節正常的認知功能[22]。本研究發現，CUMS大鼠腦組織皮質和海馬區小膠質細胞激活。有研究顯示，慢性刺激下，小膠質細胞激活，介導產生促炎性細胞因子，使小膠質細胞吞噬清除Aβ的能力受損[20]。本研究表明，CUMS造模下，腦組織小膠質細胞內Aβ水平升高。細胞內Aβ水平升高可能與細胞外Aβ生成增多、細胞內降解下降有關。激活的小膠質細胞分泌各種信號分子作用于其他神經細胞導致Aβ生成增多[23]，還可減少腦內胰島素降解酶的分泌，抑制Aβ的降解，導致Aβ沉積[12]?；罨男∧z質細胞清除Aβ的能力降低，促進Aβ的積累，導致認知障礙病理進程的發展[24]。

RAGE和TLR4在中樞神經系統的小膠質細胞內高表達，研究發現，Aβ與小膠質細胞表面的RAGE或TLR4結合，誘導小膠質細胞的激活，使炎癥水平升高，可能引起神經元損傷，導致學習、記憶和認知能力降低[25]。在AD患者和動物中均發現，腦(包括海馬區)內小膠質細胞中RAGE和TLR4表達增加，且當小膠質細胞向Aβ靠攏時，其將高度表達細胞表面受體RAGE和TLR4等，從而使受體能夠識別Aβ并與之結合攝入細胞內，使腦內Aβ的水平增加[26]。本研究發現，大鼠腦組織中小膠質細胞在12周慢性刺激下被激活，并可能上調小膠質細胞內RAGE和TLR4受體表達，促進對Aβ的吞噬，進而導致細胞內Aβ的積累。

綜上，慢性應激可引起腦內Aβ含量增加和認知能力的減退，這可能與激活腦內小膠質細胞，小膠質細胞Aβ攝取受體RAGE和TLR4表達上調，造成小膠質細胞對Aβ的攝取增加、清除減弱有關。