豬瘟病毒E2基因主要抗原區表達及Dot-ELISA建立研究

蘇紅遼 宗玉國

（1河南省滑縣動物衛生監督所，河南安陽 456400；2山東省臨朐縣綜合行政執法局，山東濰坊 262600）

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染豬引起的一種急性或慢性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。該病臨床癥狀以發病豬死亡、懷孕母豬繁殖障礙為主要特征，臨床危害嚴重，被世界動物衛生組織(World Organization for Animal Health,WOAH) 列為必須報告疫病[2]，我國將其列為二類動物疫病。歐洲部分發達國家已宣布成功消滅豬瘟，但包括我國在內的多數養豬國家和地區仍存在此病[3,4]，甚至部分已宣布消滅豬瘟的國家仍不時發生[5]，嚴重影響全球養豬業的健康發展[6]。以C株為代表的豬瘟弱毒疫苗在消滅、凈化豬瘟過程中發揮了重要作用，但因實際免疫中存在盲目接種、接種后缺乏免疫效果監測甚至因免疫抑制等原因導致免疫失敗[7]。因此，對生豬養殖場戶、基層動物疫病預防控制機構而言，找到一種適宜于現地使用的CSFV抗體快速檢測方法，有助于第一時間掌握豬群的豬瘟抗體水平，便于采取針對性防控措施。

依據我國發布的豬瘟診斷技術標準(GB/T 16551-2020)，豬瘟抗體檢測方法主要有病毒中和試驗、酶聯免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫熒光試驗等，但這些方法的使用場景主要以獸醫實驗室為主，且對人員、技術、設施、儀器等的要求相對較高，并不適宜養殖圈舍的現場使用。為此，本研究在分析了CSFVE2基因的主要抗原區域后，進行了E2基因的克隆、表達、純化，經SDS-PAGE、Western blotting分析，表達的重組蛋白E2能夠與CSFV陽性血清特異性結合，基于純化的重組E2蛋白作為檢測抗原，初步建立能檢測豬瘟抗體的斑點酶聯吸附試驗(Dot-ELISA)，該方法保留了常規ELISA的優點，克服了繁瑣的操作程序，檢測結果能直接肉眼觀察，易于基層推廣應用[8]，將結果報道如下。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌(毒)株和質粒

豬瘟病毒、原核表達載體pET-28a(+)以及表達宿主菌Rosetta均由河南省滑縣動物疫病控制中心保存。

1.1.2 主要試劑

TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0、Taq DNA聚合酶、EcoR I、Xho I和DNA膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶均購自Takara；HRP標記羊抗豬IgG、BCA蛋白定量試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Immobilon ECL發光液購自Millipore公司；豬瘟陽性血清由河南省滑縣動物疫病控制中心采集、鑒定并保存。

1.1.3 引物

根據Genebank中收錄的CSFV Qixian株E2基因序列(KY816738)，利用primer5.0設計1對擴增E2主要抗原區dE2的引物，預期擴增產物的大小為762 bp。引物序列：上游引物5’-GAGGAATTCAACCCATCA ACTGAGGAAATG-3’，下游引物5’-TATCTCGAGTT C TGCGAAGTAATCTGAGTGG-3’ (下劃線分別為EcoR I和 Xho I位點)。

1.2 E2基因的RT-PCR擴增

1.2.1 cDNA合成

cDNA合成按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0說明書進行。

1.2.2 PCR擴增

PCR體系及反應參數分別如下，10×Taq DNA聚合酶緩沖液 5 μL、反轉錄 cDNA 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 pmol/L上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，滅菌超純水補至50 μL；反應參數是 95℃ 5 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 46 s，33個循環；72℃延伸6 min。

1.3 pET28a-dE2的構建

將E2基因PCR產物經核酸電泳、切膠回收純化，再用EcoR I和Xho I雙酶切后回收，與經EcoR I和Xho I酶切并回收的產物與pET-28a(+)連接，連接如下：E2 基因 4 μL，pET-28a(+)1 μL，5×T4 DNA連接酶緩沖液2 μL，T4 DNA連接酶1 μL，滅菌超純水補至 10 μL，16℃過夜。轉化 Rosetta，涂布于含 100 μg/mL卡那霉素(Kan) 的LBA平板上，37℃培養14～16 h，挑單菌落，培養后，分別進行PCR和雙酶切鑒定，陽性質粒命名為pET28a-dE2，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并進行NCBI BLAST分析。

1.4 pET28a-dE2的誘導表達

挑取pET28a-E2質粒轉化的Rosetta，接種于含100 μg/mL Kan的LB液體培養基，37℃振搖培養至A600為0.5～0.6，加入0.1 mol/L IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，37℃繼續振搖培養6 h，備用。

1.5 E2基因的SDS-PAGE和Western blotting分析

1.5.1 SDS-PAGE分析

誘導培養物于4℃下3 000 r/min離心10 min，收集菌體，PBS洗滌，用1/10菌液體積的PBS重懸菌體，冰浴超聲裂解菌體，4℃12 000 r/min離心10 min，收集上清，12%SDS-PAGE，染色，脫色，檢測表達蛋白。同時設未誘導的pET28a-E2’為對照。

1.5.2 Western blotting分析

通過Western blotting分析E2基因的蛋白表達，方法參考文獻[9]，同時設未誘導的pET28a-E2’為對照。

1.6 Dot-ELISA方法的初步建立

純化的dE2包被NC膜，建立檢測E2抗體的Dot-ELISA方法如下：剪取硝酸纖維素膜，30 ng/μL的E2抗體，取1 μL涂于NC膜，37℃溫箱干燥，10%脫脂奶粉37℃封閉1 h，PBST洗滌，CSFV抗體陽性血清(1∶200稀釋)4℃孵育過夜，PBST洗滌，1∶3 000稀釋HRP標記的羊抗豬IgG 37℃孵育30 min，PBST洗滌5次，置于AEC顯色液中，至出現斑點后，終止顯色。

2 結果與分析

2.1 E2基因主要抗原區的擴增

TR-PCR擴增獲得了長度約為760 bp的E2基因片段(圖1)，與預期片段長度一致。

圖1 E2基因RT-PCR擴增

2.2 pET28a-dE2的鑒定

pET28a-dE2的PCR鑒定獲得了約760 bp的片段(圖2-A)，pET28a-dE2的EcoR I和Xho I雙酶切鑒定獲得了約530和760 bp的DNA片段(圖2-B)，與預期一致，表明E2基因擴增片段入pET-28a(+)載體。NCBIBLAST分析表明，擴增基因與我國CSFV分離株的E2基因對應序列的同源性≥98.84%以上(見圖3)。

圖2 pET28a-dE2的PCR(A)及雙酶切 （B）鑒定

圖3 E2基因主要抗原區序列Blast比對結果

2.3 E2重組蛋白的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析結果(圖4-A)顯示，pET28adE2經IPTG誘導表達了約32.4 KDa的重組蛋白，而未誘導pET28a-dE2’轉化菌則未見相應條帶，與預期結果一致，表明E2基因主要抗原區已獲得成功表達。

2.4 dE2重組蛋白的Western blotting分析

Western blotting結果(圖4-B)表明，pET28a-E2誘導菌在約32.4 KDa處有特異性條帶，而未誘導pET28a-E2’轉化菌則未見相應條帶，表明誘導菌中表達的E2蛋白能夠與CSFV感染陽性血清發生特異性反應。

2.5 Dot-ELISA方法的初步建立

由Dot-ELISA顯色結果(圖4)可知，純化dE2與CSFV抗體陽性血清反應，有可見斑點，而等量未誘導的菌體蛋白則不與CSFV抗體陽性血清反應，無可見斑點，表明重組蛋白作為包被抗原建立的Dot-ELISA，可檢測豬血清中的CSFV抗體。

圖4 E2重組蛋白的SDS-PAGE （A）和Western blotting （B） 分析

圖4 重組蛋白的Dot-ELISA

3 討論與結論

豬瘟是由豬瘟病毒引起豬的一種高度傳染性疾病，呈急性或慢性經過，分布范圍廣，世界各地都有發生，能導致發病豬的死亡及母豬的繁殖障礙。當前，通過豬瘟疫苗接種和嚴格的生物安全措施，豬瘟的流行得到了有效控制。但我國在豬瘟免疫時間方面，由于缺乏及時、準確的免疫監測，導致免疫時機的選擇具有很大的盲目性，常造成免疫失敗[10,11]。相較于需要專業技術人員、專用設備的商品化CSFV抗體檢測試劑盒，建立簡便、易行、可現場使用的豬瘟抗體檢測方法，及時對豬瘟抗體進行監測，給免疫時機選擇提供參考，并且及時檢測免疫效果，才是廣大養殖場戶和基層動物防疫機構開展豬瘟免疫并確保免疫效果的重要保障[5]。

鑒于Dot-ELISA的豬瘟抗體檢測方法操作簡便、易行，并且不需要特殊儀器設備讀取檢測結果，便于在基層推廣應用[12]。E2是豬瘟病毒重要保護性抗原[13]，本研究首先分析了E2主要抗原區，RT-PCR擴增了E2的主要抗原區(dE2)，構建了重組表達載體pET28a-dE2，并利用SDS-PAGE和Western blotting成功表達了豬瘟病毒的重組蛋白抗原和特異性結合豬瘟抗體，然后利用表達的重組蛋白建立了檢測豬瘟抗體的Dot-ELISA，為豬群豬瘟抗體檢測提供了有效工具，通過豬瘟抗體檢測，不僅可為豬瘟免疫時機選擇提供參考，而且可以及時了解豬瘟免疫接種效果。此外，NCBI BLAST分析，發現本研究擴增的豬瘟病毒E2的主要抗原區與多個毒株E2基因對應序列的同源性≥99.8%，多數可達100%。表明本研究建立的Dot-ELISA，在檢測豬群豬瘟抗體時具有較好的代表性和通用性，可為豬瘟病毒抗體檢測提供有效工具。