非洲豬瘟檢測樣品的選擇

許光勇 陳華林 周 磊

（1北京奶牛中心，北京 100192；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3北京中育種豬有限責(zé)任公司，北京 100194；4中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193）

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是豬感染非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)后呈現(xiàn)熱性、出血性、高度接觸性的一種傳染病，臨床上主要以發(fā)燒、出血、采食量下降或廢絕、精神萎靡和流產(chǎn)為特征[1]。非洲豬瘟是世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定的法定報告動物疫病，我國將其列為一類傳染病。自2018年非洲豬瘟首次出現(xiàn)在我國以來，其對生豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展影響巨大，最終導(dǎo)致2020年生豬行情創(chuàng)歷史新高，同時也改變了我國生豬養(yǎng)殖模式與格局，此后集團(tuán)化樓房養(yǎng)豬模式如“雨后春筍般拔地而起”。截至目前，沒有任何有效的疫苗和藥物可以控制非洲豬瘟[2]，規(guī)模化豬場主要依靠構(gòu)建高級別的生物安全體系進(jìn)行防控，當(dāng)前，關(guān)口前置、早期診斷識別和精準(zhǔn)剔除等核心技術(shù)是防控非洲豬瘟的關(guān)鍵。本試驗主要以感染ASFV豬場為研究對象，對比豬群感染ASFV前期、中期、后期3個階段，采集的環(huán)境樣品、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、靜脈血和尾根血等樣品中檢測出ASFV核酸的敏感性，從而明確各個階段診斷ASF所需采集的最佳樣品種類，為指導(dǎo)豬場非洲豬瘟精準(zhǔn)防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗豬

2021年感染ASFV的豬場，選擇飼養(yǎng)于限位欄中，且臨床癥狀以采食量下降或不食、發(fā)燒、流產(chǎn)為表現(xiàn)的母豬50頭。

1.2 主要試劑

ZTLYB-Y64 Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒(批號為21082310T035)，購自西安天隆科技有限公司；非洲豬瘟病毒核酸定量PCR檢測試劑盒(批號為2021027)，購自北京明日達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.3 主要儀器

NP968-C全自動核酸提取儀、96R實時熒光定量PCR儀、PANA9600S全自動核酸工作站，西安天隆科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 方法

時間點(diǎn)以母豬現(xiàn)場出現(xiàn)采食量下降或不食、發(fā)燒、流產(chǎn)、精神萎靡為第1 d，第1～3 d為感染前期，4～7 d為感染中期，8～21 d為感染后期。ASFV感染前、中、后期的異常母豬均采集個體對應(yīng)的環(huán)境樣品(料槽與排便區(qū)使用紗布滾輪或擦拭采集的樣品)、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、靜脈血和尾根血6種樣品。

1.5 非洲豬瘟病毒核酸檢測

PCR反應(yīng)(25 μL體系) 條件：50℃2 min；95℃3 min；95℃10 s，60℃20 s，40個循環(huán)。試驗成立條件：陽性對照Ct值≤30，有明顯指數(shù)增長，呈典型S型曲線；陰性對照無Ct值，無明顯指數(shù)增長期和平臺期。結(jié)果判定：檢測樣品Ct值≤40，有明顯指數(shù)增長，則為ASFV核酸陽性；無Ct值判定為陰性。

2 結(jié)果與分析

采集試驗所用50頭異常母豬感染早期(1～3 d)、中期(4～7 d)和后期(8～21 d)的環(huán)境樣品、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、靜脈血和尾根血6種樣品共計900份，定量PCR檢測ASFV核酸，其結(jié)果見表1。

由表1結(jié)果可知，ASFV感染前期咽部拭子樣品非洲豬瘟病毒的陽性率最高，且與其他樣品陽性率差別較大，Ct值最低，血液沒有檢出ASFV核酸。感染中期各類樣品均可檢出非洲豬瘟病毒核酸，其中尾根血非洲豬瘟病毒核酸陽性率最高為26%，靜脈血與環(huán)境樣品陽性率也較高，分別為20%和24%，比較接近，但血液樣品的Ct值低于環(huán)境樣品。感染后期，環(huán)境樣品非洲豬瘟病毒核酸陽性率最高達(dá)54%，而血液樣品的陽性率也在50%，血液Ct值低至26.9～28.7，而環(huán)境樣品的Ct值為35.1，說明此階段血液載毒量較高。

表1 不同感染階段6種樣品ASFV核酸結(jié)果

綜合檢測結(jié)果、現(xiàn)場操作便捷性與安全性等因素，認(rèn)為ASFV感染不同階段，其最佳檢測樣品分別為：非洲豬瘟病毒感染早期選擇咽拭子樣品、非洲豬瘟病毒感染中期選擇尾根血、非洲豬瘟病毒感染后期選擇環(huán)境樣品。

3 討論

非洲豬瘟傳入我國已有3年，對生豬養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，非洲豬瘟是當(dāng)前養(yǎng)豬場防控最重要的疫病，且其防控已呈現(xiàn)常態(tài)化[3]。當(dāng)前，生物安全是控制非洲豬瘟最有效的措施，其關(guān)鍵措施包括分區(qū)管理、關(guān)口前置、日常監(jiān)測等，均是圍繞車輛、物資、人員、豬群、環(huán)境等5大主要載體開展工作。一旦非洲豬瘟病毒進(jìn)入豬場感染豬群，需要有一套快速有效的應(yīng)急反應(yīng)預(yù)案，其核心就是在第一時間將ASFV感染控制在最小范圍，阻止大面積交叉?zhèn)鞑ィ员悻F(xiàn)場開展精準(zhǔn)剔除，將損失降至最低。ASF潛伏期或發(fā)病早期，快速準(zhǔn)確識別出ASFV感染豬乃是精準(zhǔn)剔除的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，本試驗選擇了環(huán)境樣品、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、靜脈血和尾根血6種樣品作為ASFV感染早期、中期和晚期檢測ASFV核酸的研究對象，通過比較ASFV核酸陽性率和Ct值，明確了ASFV感染3個時期需選擇的最合適的樣品種類。

50頭異常母豬于感染早期、中期和晚期采集環(huán)境樣品、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、靜脈血和尾根血6種樣品，提取病毒核酸后定量PCR檢測ASFV核酸。由結(jié)果可知，因感染早期血液未檢出ASFV核酸，所以血液一般不適用于ASFV感染前期的排查。雖然環(huán)境樣品和肛拭子也檢出了病毒核酸陽性，但咽拭子的陽性檢出率更高。而鼻拭子中非洲豬瘟病毒核酸陽性檢出率為20%，與咽拭子比較雖有差別，但采樣方法簡單便捷，必要時可考慮使用。因此，感染非洲豬瘟病毒早期最佳檢測樣品為咽拭子，其次是鼻拭子，該結(jié)論在理論上與ASFV感染后排毒的時間點(diǎn)相吻合。由于拭子采樣方法需要直接接觸豬乃口腔或鼻腔，因此，現(xiàn)場操作一定要關(guān)注采樣人員的操作方式、更換佩戴手套、重復(fù)使用工具的消毒等細(xì)節(jié)，杜絕出現(xiàn)人為傳播感染。

非洲豬瘟病毒感染中期6種樣品均可檢出ASFV核酸陽性，分別是尾根血、靜脈血、肛拭子和環(huán)境樣品的核酸陽性率在18%～26%之間，Ct值在31.3～36.1之間。結(jié)果表明，尾根血與靜脈血檢出ASFV核酸陽性率和Ct值均為最佳，綜合考慮實驗室檢測和現(xiàn)場操作，最后認(rèn)為尾根血采集更加便捷、安全。因此，非洲豬瘟病毒感染中期尾根血為檢測ASFV核酸檢測的最佳樣品。雖然采集尾根血相對安全，但其所采集數(shù)量偏少，不利于開展多次檢測，例如多次鑒別診斷。尾根血采集技術(shù)需要展開培訓(xùn)，否則采樣效率會大打折扣。

非洲豬瘟病毒感染后期，除咽拭子外，其余5種樣品仍可檢出ASFV核酸陽性。環(huán)境樣品、靜脈血和尾根血核酸陽性率較高，肛拭子核酸陽性率也達(dá)到了26%，靜脈血Ct值更是低至26.9。由此說明，非洲豬瘟病毒感染后期豬乃出現(xiàn)大量排毒。根據(jù)結(jié)果初步判定，靜脈血、尾根血、肛拭子和環(huán)境樣品均可作為檢測樣品。鑒于血液對環(huán)境、人員、工具等的污染風(fēng)險較高，故肛拭子和環(huán)境樣品優(yōu)先選擇；同時考慮到現(xiàn)場操作的便捷性和安全性，環(huán)境樣品與肛拭子相比，前者具備采樣更加方便、省時省力、不交叉污染等優(yōu)點(diǎn)。因此認(rèn)為，非洲豬瘟病毒感染后期環(huán)境樣品是最適合的檢測選擇。環(huán)境樣品是指收集豬群飼養(yǎng)區(qū)域、豬場內(nèi)環(huán)境、載體表面等相關(guān)媒介，主要有塵土、料渣、口腔液與糞便等，其收集可借助于紗布和棉簽等，環(huán)境樣品的采集十分方便，具有一定獨(dú)立性、交叉污染的概率較小。自2018年非洲豬瘟疫情在我國出現(xiàn)，環(huán)境樣品大量應(yīng)用于ASFV檢測中，但由于正常運(yùn)轉(zhuǎn)豬場的部分環(huán)境樣品攜帶ASFV病原載量較低，故其選擇也具有局限性，王久紅[4]監(jiān)測了常態(tài)化條件下，養(yǎng)豬場局部區(qū)域環(huán)境樣品ASFV核酸陽性率僅為0.63%，表明環(huán)境樣品的選擇確實存在局限性。乃有在豬群大量排毒或高劑量病原污染時，環(huán)境樣品的檢測效果較好。

4 小結(jié)

非洲豬瘟防控工作已然常態(tài)化，生物安全體系也越來越完善，且關(guān)鍵技術(shù)更加科學(xué)。本研究明確了豬感染ASFV前、中、后3個時期檢測核酸的最佳樣品種類，可以為ASF控制與精準(zhǔn)剔除病豬提供更加清晰的思路與指導(dǎo)，進(jìn)一步為促進(jìn)生豬產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展提供有力支撐。