基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組膠原蛋白分析

黃嘉文

（廣州美神生物科技有限公司，廣東廣州 510670）

膠原蛋白約占人體總蛋白的28%，屬于人體分布最為廣泛的功能性蛋白，其具有良好穩(wěn)定性，備受相關(guān)產(chǎn)業(yè)關(guān)注，但膠原蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜且類型多樣，故在分離提取與生產(chǎn)重組中存在一定困難。隨著科技的不斷進(jìn)步，可運(yùn)用基因工程技術(shù)進(jìn)行膠原蛋白的生產(chǎn)重組，在先進(jìn)技術(shù)驅(qū)動下，重組膠原蛋白生產(chǎn)量有所提升，對于膠原蛋白的生產(chǎn)重組開發(fā)研究項(xiàng)目逐漸推進(jìn)。

1 膠原蛋白結(jié)構(gòu)分析

膠原蛋白由多個(gè)原膠原構(gòu)成，各原膠原均由三條α-螺旋肽鏈組成，各肽鏈長約一千個(gè)氨基酸殘基，三條α-螺旋肽鏈纏繞而形成了三重螺旋結(jié)構(gòu)[1]。膠原左旋α鏈僅螺旋纏繞構(gòu)成的復(fù)合螺旋結(jié)構(gòu)被稱為螺旋區(qū)段，其最大特征在于周期性排列。在膠原蛋白結(jié)構(gòu)中，羥脯氨酸、脯氨酸占比最高，可達(dá)25%，此外，羥基賴氨酸僅存在于膠原蛋白結(jié)構(gòu)中，其他蛋白質(zhì)均不含有羥基賴氨酸，且羥基賴氨酸無法參與生物合成，僅可從膠原肽鏈中轉(zhuǎn)化獲取。

2 膠原蛋白借助基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)重組的方向

動物膠原蛋白存在不穩(wěn)定性，且具有一定風(fēng)險(xiǎn)，為切實(shí)發(fā)揮出膠原蛋白的優(yōu)勢，主要探究基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人膠原蛋白的方式。現(xiàn)階段基因工程技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中，主要將轉(zhuǎn)基因動植物、酵母、細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞作為宿主細(xì)胞進(jìn)行人膠原蛋白的生產(chǎn)重組，可獲得質(zhì)量穩(wěn)定、安全性好的膠原蛋白產(chǎn)品，解決了傳統(tǒng)辦法所存在的病毒隱患及免疫排異性問題。

2.1 動植物生產(chǎn)重組

將αS1-乳腺酪蛋白基因片段及膠原蛋白基因片段進(jìn)行基因工程重組，以轉(zhuǎn)基因鼠乳腺細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，以此可獲得人I型原膠原，在鼠乳三螺旋結(jié)構(gòu)中，同型三聚體質(zhì)量濃度可達(dá)8mg/mL[2]。通過該基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組方式能夠?qū)崿F(xiàn)較高產(chǎn)量，但所獲得的膠原蛋白羥脯氨酸含量不達(dá)正常水平的一半，結(jié)合該結(jié)果來看，推測乳腺P4H可對羥基化產(chǎn)生限制，此時(shí)可通過P4H轉(zhuǎn)入編碼降低該限制，從理論上看，可采用該方式獲得大量重組膠原，但該方式并未完全消除安全隱患，故在實(shí)踐生產(chǎn)重組中并未采用。

依托于基因工程技術(shù)，可應(yīng)用基因注入辦法進(jìn)行表達(dá)重組，例如：結(jié)合轉(zhuǎn)基因蠶絲腺來看，其長度較短，為1/3的人膠原蛋白長度，且因其絲腺內(nèi)P4H成分活力較低，無法良好完成羥基化過程，導(dǎo)致膠原蛋白表達(dá)重組效果不佳，針對該現(xiàn)象，可依托于基因工程技術(shù)，采用基因注入的方式提升絲腺P4H活力，經(jīng)處理后解決了脯氨酸無法充分羥基化的現(xiàn)象。在基因注入過程中，可將桿狀病毒IE-1注入到絲腺中，通過該操作可提升蠶繭干質(zhì)量，使蛋白結(jié)果能夠直接分泌到蠶絲絲膠層，使膠原蛋白的純化與提取更為便捷。

從植物角度來看，可將人膠原蛋白及P4H對應(yīng)基因嵌入到煙草植株中，通過該基因工程技術(shù)操作，能夠活動完整羥基化地重組膠原蛋白。在上述表達(dá)重組過程中，需借助瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)完成膠原蛋白的表達(dá)重組，使修飾酶能夠在煙草植株中完成表達(dá)，以此有效提高重組蛋白質(zhì)量。除此之外，在現(xiàn)有研究中，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)了大麥重組表達(dá)重組膠原蛋白。從當(dāng)前基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組膠原蛋白產(chǎn)業(yè)發(fā)展來看，動植物細(xì)胞存在成本高、難度高的限制，無法實(shí)現(xiàn)規(guī)模化膠原蛋白生產(chǎn)，故從產(chǎn)業(yè)發(fā)展角度來看，宿主細(xì)胞選擇微生物較為合適。

2.2 微生物生產(chǎn)重組

在現(xiàn)有研究中，可結(jié)合人膠原α1鏈膠原域序列特征提高膠原蛋白表達(dá)量，并以此為依據(jù)合成親水性良好的重復(fù)序列基因單體，進(jìn)一步采用同向串聯(lián)的方式構(gòu)建人膠原蛋白表達(dá)載體，并使其轉(zhuǎn)化為畢赤酵母，以此完成人膠原蛋白的表達(dá)重組。此外，單體同向串聯(lián)操作期間能夠按時(shí)間需求獲得不同的蛋白基因，且所表達(dá)重組膠原蛋白產(chǎn)物能夠良好實(shí)現(xiàn)分離純化，同時(shí)畢赤酵母生產(chǎn)周期短，從某種程度上降低了生產(chǎn)重組成本。將微生物作為宿主細(xì)胞時(shí)，可通過酶解工藝、凍干工藝、透析工藝、滅菌工藝制備人膠原蛋白，通過一系列處理可將膠原蛋白質(zhì)量提升至99.8%，極大降低DNA殘留量，膠原蛋白結(jié)構(gòu)N末端、C末端肽濃度遠(yuǎn)低于檢測限度[3]。通過上述工藝操作，對酶解工藝的端肽去除效果進(jìn)行了驗(yàn)證，可在人膠原蛋白制備期間大幅降低其免疫原性。

對現(xiàn)有微生物表達(dá)重組膠原蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)適宜羥基化的膠原蛋白進(jìn)行生產(chǎn)表達(dá)重組時(shí)，可將畢赤酵母作為宿主細(xì)胞，以此產(chǎn)生人膠原蛋白α1鏈，采用共同表達(dá)P4H的方法確保人膠原蛋白α1鏈中含有羥脯氨殘基。為進(jìn)一步驗(yàn)證該生產(chǎn)表達(dá)重組效果，可應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析法，選取重組膠原蛋白進(jìn)行檢測，以此獲得羥基化脯氨酸表達(dá)情況。

膠原蛋白現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到化妝品、護(hù)膚品中，但在于皮膚吸收外用膠原蛋白的有效性方面仍存有一定爭議，若外用膠原蛋白無法被人體皮膚良好吸收，將無法切實(shí)發(fā)揮出外用膠原蛋白的作用，且可造成一定資源浪費(fèi)。針對這一問題，可應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人膠原蛋白，選取皮膚存在激光損傷的小鼠進(jìn)行修復(fù)實(shí)驗(yàn)，以此了解外用膠原蛋白對人體皮膚的效果。在該實(shí)驗(yàn)的前期研究中，結(jié)合二次諧波及熒光成像方式，對重組人膠原蛋白皮膚吸收情況進(jìn)行觀察，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組人膠原蛋白能夠沿毛囊逐漸進(jìn)入皮膚真皮層，同時(shí)不斷擴(kuò)散到達(dá)膠原纖維層，借助人膠原蛋白實(shí)現(xiàn)人體皮膚膠原纖維的補(bǔ)充。在激光損傷下小鼠皮膚修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用460～510nm的激光照射小鼠皮膚，在其背部造成激光損傷效果，此時(shí)將基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組的人膠原蛋白均勻涂抹至小鼠激光損傷皮膚處，在實(shí)際涂抹處理時(shí)，運(yùn)用生理鹽水將人膠原蛋白配置為8mg/mL的劑量，按照每日涂抹一次，連續(xù)涂抹14d的修復(fù)方案進(jìn)行涂抹。在人膠原蛋白涂抹后1d、4d、7d、14d進(jìn)行觀察記錄，為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化修復(fù)效果觀察，需借助雙光子顯微鏡檢測小鼠背部激光損傷處的膠原纖維情況，為便于觀察，可進(jìn)行HE染色，以此直觀化觀察背部激光損傷處的病理學(xué)變化[4]。完成上述觀察操作后檢測膠原纖維細(xì)胞增殖活力情況，同時(shí)對細(xì)胞存活率進(jìn)行計(jì)算。將對照組與實(shí)驗(yàn)組損傷處理效果進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)人膠原蛋白能夠縮小皮膚損傷處的恢復(fù)時(shí)間，由此可證明，人膠原蛋白能夠被皮膚良好吸收，其作用原理在于提升皮膚成纖維細(xì)胞的活力，并促進(jìn)其增殖。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)可見，經(jīng)基因工程生產(chǎn)重組的人膠原蛋白能夠被皮膚良好吸收，且可對損傷皮膚起到一定修復(fù)效果。

3 重組膠原蛋白產(chǎn)品功效分析

STEE HILL溯華重組膠原蛋白緊致彈力套裝由潔面乳、柔膚水、精華乳、精華液、面霜構(gòu)成，其采用基因工程技術(shù)完成的膠原蛋白生產(chǎn)重組工作，為探究基因工程技術(shù)在膠原蛋白生產(chǎn)重組中的作用，了解重組基因蛋白在護(hù)膚品中的功效，本次選取STEE HILL溯華重組膠原蛋白緊致彈力套裝進(jìn)行檢測。

3.1 測試概況

本次STEE HILL溯華重組膠原蛋白緊致彈力套裝檢測的主要目的是為驗(yàn)證產(chǎn)品的抗皺、保濕作用，間接驗(yàn)證經(jīng)基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組膠原蛋白的應(yīng)用效果，通過驗(yàn)證相關(guān)產(chǎn)品功效而判斷基因工程技術(shù)在膠原蛋白生產(chǎn)重組中的作用。在測試期間，需從皮膚角質(zhì)層水分含量、皮膚皺紋數(shù)量、皮膚皺紋面積、皮膚皺紋長度四個(gè)方面進(jìn)行測試，同時(shí)采用實(shí)驗(yàn)室專家評估法進(jìn)行皺紋等級評分，該項(xiàng)評分存在一定主觀性因素，故僅作為參考意見，此外，對受試者（共計(jì)31人）自我評估看法進(jìn)行采集，發(fā)現(xiàn)套裝內(nèi)五款產(chǎn)品均獲得了93.5%以上滿意度，其中潔面乳更是達(dá)到了100%滿意。在該次重組膠原蛋白緊致彈力套裝檢測中，發(fā)現(xiàn)該套裝產(chǎn)品在使用14d后能夠表現(xiàn)出優(yōu)異的保濕效果，使用28d后即可表現(xiàn)出良好的除皺效果。

3.2 測試方案

STEE HILL溯華重組膠原蛋白緊致彈力套裝樣品主要作用于時(shí)受試者面部，每日早晚各使用一次，連續(xù)使用28d。產(chǎn)品的使用方法如下：每日潔面后，按照柔膚水、精華液、精華乳、面霜的順序進(jìn)行使用。對受試者基本信息進(jìn)行采集，在本次測試實(shí)驗(yàn)中，受試者共計(jì)31人，均為女性，且年齡均處于30～50歲，受試者膚質(zhì)要求如下：面部松弛、敏感肌膚、有皺紋者，皺紋評分1～3分，其中有8人為1級皺紋等級，15人為2級皺紋等級，10人為3級皺紋等級，角質(zhì)層水分含量≤60c.u，皮膚彈性R2≤0.2，對受試者情況進(jìn)行篩選，最終獲得31名有效數(shù)據(jù)。

3.3 測試結(jié)果

從皮膚角質(zhì)層水分含量來看，與使用樣品前相比，31名受試者在使用樣品14d后，臉頰部位皮膚角質(zhì)層水分含量提升了5.23%，有顯著性差異；在使用樣品28d后，臉頰部位皮膚角質(zhì)層水分含量提升了3.88%，無顯著性差異。

從皮膚皺紋數(shù)量（見圖1）來看，與使用樣品前相比，31名受試者在使用樣品14d后，眼底部位皺紋數(shù)量降低了28.32%，眼角部位皺紋數(shù)量降低了26.99%，有顯著性差異；在使用樣品28d后，眼底部位皺紋數(shù)量降低了30.11%，眼角部位皺紋數(shù)量降低了29.83%，有顯著性差異。

圖1 各時(shí)間點(diǎn)皮膚皺紋數(shù)量（P＜0.05）

從皮膚皺紋面積（見圖2）來看，與使用樣品前相比，31名受試者在使用樣品14d后，眼底部位皺紋面積降低了10.03%，眼角部位皺紋面積降低了12.032%；有顯著性差異；在使用樣品28d后，眼底部位皺紋面積降低了10.82%，眼角部位皺紋面積降低了14.87%，有顯著性差異。

圖2 各時(shí)間點(diǎn)皮膚皺紋面積（P＜0.05）

從皮膚皺紋長度（見圖3）來看，與使用樣品前相比，31名受試者在使用樣品14天后，眼底與眼角的皺紋長度分別降低了11.06%、13.91%，有顯著性差異；使用樣品28天后，眼底與眼角的皺紋長度分別降低了12.28%、16.07%，有顯著性差異。

圖3 各時(shí)間點(diǎn)皮膚皺紋長度（P＜0.05）

綜上所述，STEE HILL溯華重組膠原蛋白緊致彈力套裝在使用14d后有保濕效果，在使用28d后有抗皺效果。

4 結(jié)束語

基因工程技術(shù)的應(yīng)用極大提高了膠原蛋白生產(chǎn)重組效率，使膠原蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定供應(yīng)，繼而使其在化妝品、醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域中發(fā)揮實(shí)效。動物膠原蛋白具有不穩(wěn)定性，且存在一定風(fēng)險(xiǎn)，故在當(dāng)前膠原蛋白生產(chǎn)重組中，多以人膠原蛋白的動植物表達(dá)、微生物表達(dá)生產(chǎn)重組為主。結(jié)合案例重組膠原蛋白護(hù)膚品檢測結(jié)果來看，該款護(hù)膚品在抗皺、保濕方面具有顯著效果，而其功效的實(shí)現(xiàn)則是基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組膠原蛋白的結(jié)果。