噻苯達唑聯合抗真菌藥物對新生隱球菌的體外抑菌效應

唐 煉, 孫 毅, 李 娟

(1. 長江大學, 湖北 荊州, 434100; 長江大學附屬荊州醫院, 2. 皮膚病與性病科,3. 全科醫學科, 湖北 荊州, 434100)

隱球菌是一種廣泛存在于周圍環境的機會致病菌，尤其是被鴿糞污染的土壤中[1], 其中人類可感染的隱球菌主要為新生隱球菌和格特隱球菌。隱球菌病最早于1894年被發現，目前已成為全球性分布的侵襲性真菌病(IFP)[2]。近年來，由于化療、器官移植免疫抑制治療的廣泛應用和人類免疫缺陷病毒感染的流行，新生隱球菌的感染率明顯上升[3]。隨著新生隱球菌耐藥性的上升[4-5], 新生隱球菌感染已成為全球性的公共衛生問題，每年可造成100多萬人感染和約60萬人死亡[6], 因此臨床亟需探尋新的抗真菌藥物靶點。

噻苯達唑(TBZ)既是真核生物微管蛋白抑制劑(可破壞微管的定位和抑制其組裝)[7], 也是延胡索酸還原酶抑制劑(可影響真核細胞內線粒體氧化呼吸鏈)，理論上具有驅蟲及抗真菌作用[8]。本研究參照美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)頒布的M27-A3方案，測定TBZ和抗真菌藥物氟康唑(FLU)、兩性霉素B(AMB)、泊沙康唑(POS)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VOR)單獨應用對20株新生隱球菌臨床株的最低抑菌濃度(MIC)，并觀察TBZ分別聯合FLU、AMB、POS、ITR、VOR對新生隱球菌的體外協同抑菌效果，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株: 本研究選用荊州市中心醫院真菌實驗室保存的20株新生隱球菌臨床株進行實驗，菌株均已進行形態學和分子生物學鑒定，且實驗開始前使用沙堡式瓊脂培養基活化2～3 d(37 ℃)。藥敏試驗應用近平滑念珠菌ATCC22019作為質控菌株。

1.1.2 藥物: TBZ(批號148-79-8, 純度>99%)、AMB(批號1397-89-3, 純度≥98%)、POS(批號171228-49-2, 純度>99%)、FLU(批號86386-73-4, 純度>99%)、VOR(批號137234-62-9, 純度>99%)和ITR(批號84625-61-6, 純度>99%), 均購自Selleck公司。將上述藥物用二甲亞砜(DMSO)配置并保存，濃度均為1 600 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 菌液和藥液制備: 參照CLSI M27-A3方案中推薦的方法配制培養基，將經過三氮嗎啡啉丙磺酸鈉緩沖(pH值7.0)的RPMI 1640液體培養液過濾滅菌。用無菌0.9%氯化鈉注射液收集新生隱球菌孢子，用血細胞計數板調整孢子量為(1～5)×106CFU/mL, 然后用RPMI 1640 液體培養液稀釋1 000倍，最后得到的菌液濃度為(1～5)×103CFU/mL。TBZ用倍比稀釋法配制7個濃度梯度且濃度為0.5～32.0 μg/mL, FLU、POS、AMB、VOR和ITR用倍比稀釋法配制8個濃度梯度且濃度均為0.062 5～8.000 0 μg/mL。

1.2.2 藥敏試驗: 聯合藥敏試驗采用棋盤法，將菌液和2種藥物分別加入96孔培養板中[9]。首列(首行)第1孔作為生長對照孔(無藥物孔)，第2～8行濃度依次遞增地加入TBZ 50 μL, 每行9孔，第2～9列濃度依次遞增加入1種抗真菌藥物50 μL, 每列8孔，再向生長對照孔和有藥液的孔加入100 μL菌液，最后向第1列的1～8孔和第1行的1～9孔加入RPMI 1640液體培養液50 μL, 每1種菌液均使用5個96孔培養板，將TBZ分別與FLU、POS、AMB、VOR、ITR中的1種采用上述棋盤法操作后置于培養箱培養24 h后觀察結果。

1.2.3 MIC測定和分數抑菌濃度指數(FICI)計算: 除AMB的MIC是與生長對照孔相比100%生長抑制所對應的最低濃度外，其余藥物的MIC是與生長對照孔相比50%生長抑制所對應的最低濃度，讀取各藥物單獨和聯合用藥時的MIC。FICI指聯合用藥時各藥MIC值除以單獨用藥時MIC值的商之和，即FICI=MICA聯合/MICA單獨+MICB聯合/MICB單獨。FICI<0.50為協同關系, 0.50～4.00為無關, >4.00為拮抗關系。

2 結 果

本研究觀察TBZ和5種抗真菌藥物單獨應用對新生隱球菌的MIC后發現, TBZ對新生隱球菌菌株的MIC為8.0～32.0 μg/mL, 表明TBZ具有一定的抗新生隱球菌作用; 抗真菌藥物AMB、FLU、ITR、POS、VOR單獨應用對新生隱球菌菌株的MIC分別為0.250 0～8.000 0、1.000 0～8.000 0、0.062 5～2.000 0、0.062 5～4.000 0、0.062 5～1.000 0 μg/mL,提示新生隱球菌對VOR最為敏感，對AMB、FLU的敏感性較低，見表1。

表1 TBZ和5種抗真菌藥物單獨應用對20株新生隱球菌的體外抑菌效果

聯合藥敏試驗結果顯示, TBZ與抗真菌藥物聯合應用可將抗真菌藥物對新生隱球菌的MIC降低2～4倍, TBZ與AMB聯合應用對7株新生隱球菌有協同作用, TBZ與FLU聯合應用對8株新生隱球菌有協同作用, TBZ與ITR聯合應用對4株新生隱球菌有協同作用, TBZ與POS聯合應用對5株新生隱球菌有協同作用, TBZ與VOR聯合應用對1株新生隱球菌有協同作用，見表2。

表2 TBZ分別聯合5種抗真菌藥物對新生隱球菌的體外抑菌效果

3 討 論

苯并咪唑化合物TBZ具有廣泛的生物活性，對多種胃腸道線蟲及肺部、皮膚等組織內寄生蟲均有驅除效果。TBZ通過寄生蟲類脂質屏障被吸收，在蟲體細胞內與微管蛋白結合，阻礙其進一步聚合裝配成微管，進而抑制寄生蟲分泌顆粒和亞細胞器運動[10]。相關研究[11]指出，新型微管相關cap-甘氨酸蛋白Cgp1控制新生隱球菌的生長、分化和毒力，而TBZ可以影響微管的定位并抑制其組裝，此外Cgp1過表達菌株對TBZ的敏感性增加。TBZ還可以影響蟲體的能量代謝，一方面抑制蟲體對葡萄糖的攝取，導致糖原耗竭，另一方面抑制寄生性蠕蟲延胡索酸還原酶活性，而后者的催化反應是糖酵解過程不可或缺的環節，也是此類生物獲得能量的來源[12]。糖酵解受阻可使得三磷酸腺苷(ATP)生成減少，導致蟲體代謝障礙，進而實現抗寄生蟲作用。相關研究[13]證明，在真菌的生長發育中，延胡索酸還原酶同樣起著關鍵作用，其通過影響真核細胞內線粒體氧化呼吸鏈而使菌體能量代謝失衡。在大多數已知的生物體中，延胡索酸還原酶是膜結合型，氧是線粒體呼吸鏈最重要的末端電子受體[14]。有氧呼吸鏈的主要功能是將質子電轉出線粒體或細胞膜，以產生質子動力，驅動 FoF1-ATP酶合成 ATP[15]。然而，微需氧環境中低等真核生物呼吸鏈相關研究[16-17]結果表明，線粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-延胡索酸還原酶系統(延胡索酸呼吸)在無氧能量代謝中起重要作用。ENIAFE J等[18]指出，延胡索酸還原酶也可作為化療靶點在腫瘤治療中發揮作用。另有研究[19]證實，TBZ對白念珠菌、青霉菌等也具有抑制作用。

在致病性真菌感染中，新生隱球菌一直是除念珠菌屬以外最為常見的致病真菌，也是很常見的侵襲性真菌，嚴重危害患者健康，且致死率高[20]。AMB為多烯類抗生素，可與真菌胞膜上的固醇類結合，改變膜的通透性，使菌體破壞，起到殺菌作用，是目前治療新生隱球菌病的首選藥物之一[21]。臨床實踐指南[22]和專家共識[23]都建議首選AMB聯合氟胞嘧啶作為新生隱球菌病的誘導治療方案，病情穩定后首選大劑量FLU作為鞏固期治療方案，或聯合氟胞嘧啶使用，也可單用AMB、ITR、VOR，或在此基礎上聯用氟胞嘧啶。隨著越來越多的臨床耐藥菌株的出現，有報道[24]稱新生隱球菌生物膜可明顯降低菌株對唑類藥物的敏感性。因此，尋找新的抗真菌靶點，增強新生隱球菌病的療效，已成為臨床迫切需求。本研究觀察結果顯示, TBZ單獨應用具有一定的抗新生隱球菌作用，將TBZ分別與FLU、ITR、POS、VOR、AMB聯合應用可降低這5種抗真菌藥物對新生隱球菌的MIC, 其中TBZ聯合FLU或AMB的協同作用更好。值得注意的是，VOR是FLU的衍生物，對新生隱球菌的敏感性高，耐受性好[25], 但TBZ聯合VOR的協同效果并不明顯。

綜上所述，TBZ具有一定的抗新生隱球菌作用，在體外與常用抗真菌藥物FLU、ITR、POS、VOR、AMB聯用時可起到協同作用，降低抗真菌藥物對部分新生隱球菌菌株的MIC。本研究為TBZ的抗真菌作用提供了體外實驗證據，豐富了TBZ與抗真菌藥物聯合應用對新生隱球菌抑制作用的數據，未來可進一步深入研究新生隱球菌呼吸鏈關鍵酶的作用機制，從而為抗真菌藥物新作用靶點的研究提供理論依據。此外，TBZ體外抗真菌效果與體內抗真菌效果可能存在一定差異，故還需開展更多的臨床研究進一步驗證TBZ應用于新生隱球菌感染治療中的可行性。