組織工程領域中過氧化物的研究進展

古先揚, 馬敏先

(1. 貴州醫科大學附屬口腔醫院 口腔修復種植科, 貴州 貴陽, 550000;2. 貴州省貴陽市口腔醫院 口腔種植科, 貴州 貴陽, 550000)

組織工程的目標是用生物相容性替代品(如生物工程組織)替代受損、損傷或缺失的身體組織，目前組織工程在修復較小缺損時有良好的應用前景，小型植入物可以利用宿主擴散的氧氣和營養物質在植入后保持活力，但大型植入物會受到營養物和氧氣擴散的限制，導致缺氧誘導的細胞死亡，從而導致植入失敗[1-2]。氧參與維持細胞活力、生長、代謝、分化過程[3], 在無氧環境中，細胞可以通過糖酵解維持其ATP儲備，然而當細胞無法進入強大的血管網絡時，會導致葡萄糖儲備快速消耗[4]。通常組織含氧量為2%～3%, 長期極端缺氧時細胞不能維持生物分子生成和離子梯度，可能會引發細胞功能喪失，甚至死亡，阻礙組織修復與傷口愈合[5]。在天然組織中，氧氣通常只能從天然毛細血管擴散100～200 μm, 所以在>1 mm的大型非血管化支架中，細胞可獲得的氧氣與營養有限，難以維持移植的細胞的活力[6]。而缺損部位的血管網絡生成需要數天到數周的時間，在成熟的血管網形成之前，氧氣、營養物質轉運障礙，這將直接影響細胞存活率及組織修復[7-8]。理想情況下，功能性組織結構必須向支架內包裹的細胞提供氧氣、營養物質和生長因子，以確保細胞存活、增殖、分化并保持代謝活性。在人體中，組織營養物質的主要來源是通過血管系統的宿主血液供應[9]。目前在臨床中常用的一種提高體內氧濃度的療法為高壓氧療法(HBOT), 是將患者置于艙內，使其短時間承受較高的氧氣濃度和壓力的一種治療方法，可以抑制厭氧菌的生長，緩解炎癥，促進骨再生，已廣泛應用于骨髓炎，受損皮膚移植物和皮瓣等[10]。但是高壓氧療法需重復給藥治療，依賴患者依從性[11]。所以需要一種在植入初期可不間斷地向植入內部提供營養和氧氣來降低細胞死亡率，同時兼具抗厭氧菌的作用，利于組織再生[12]。氧釋放生物材料，特別是過氧化物，因其在傷口部位控制氧氣生成方面具有可調節性而備受關注[13]。本文概述過氧化物在骨、胰腺、心血管等領域的研究進展。

1 過氧化物的分類

過氧化物分為固體無機過氧化物和液體過氧化物，兩者均可向組織結構持續釋放氧氣以維持高細胞活力。將釋放氧的過氧化物結合聚合物支架的方法已越來越多地用于增強組織結構的活力[14]。

常見的固體無機過氧化物為過氧化鈣(CPO)、過碳酸鈉(SPC)、過氧化鎂(MgO2)等，與水接觸發生水解可產生氧氣。固體無機過氧化物接觸水后，第1步會生成過氧化氫，第2步是H2O2分解成氧氣[15]。液體過氧化物如過氧化氫，是一種液體化合物，在水中可快速分解成水和氧氣。由于過氧化物與水接觸后，突發釋放可能以不受控的速率發生。為了更好地控制氧釋放速率，可用疏水性材料封裝釋氧顆粒。例如選擇疏水的高分子材料聚己內酯(PCL)封裝不同濃度的CPO, 來降低植入初期CPO顆粒的分解速率[16]。

2 過氧化物在組織工程中的應用

為了達到提高局部氧濃度的效果，目前已有研究將過氧化物結合到生物材料中，形成氧釋放生物材料以達到原位產氧的目的。

2.1 骨組織工程

骨缺損區缺血缺氧仍然是治療大段骨缺損時的棘手問題。因此，近年來釋氧生物材料得到了廣泛的研究。HSIEH等[17]開發了CaO2+MnO2/PLGA可注射的復合產氧系統可以有效緩解低氧環境下生長的小鼠成骨前體細胞(MC3T3-E1)的缺氧反應，并促進其成骨分化[18]。ELHAM等[19]制作了2種不同內部結構(中空和實心)的左旋聚乳酸(PPLA)-CPO微球，并將過氧化氫酶接枝到微球表面，加速H2O2向氧的轉化，防止H2O2的積累和細胞損傷。結果顯示實心微球的氧氣釋放較中空結構更持久，同時將不含過氧化氫酶的PLLA-CPO微球與人脂肪間充質干細胞培養后，細胞活力下降在75%以下，過氧化氫酶接枝可以減弱對細胞的毒性。有研究采用3D打印技術制作由PCL、β-磷酸三鈣(β-TCP)和MgO2組成的復合支架。O2和Mg2+可以持續釋放3周左右。同時，與對照組相比，支架在缺氧條件下對骨髓間充質干細胞(BMSCs)的存活、增殖、遷移和成骨分化有明顯的促進作用。影像學研究和組織學分析結果顯示，植入PCL/β-TCP/MgO2支架可促進種子細胞存活，顯著增加新骨形成[20]。

2.2 胰腺組織工程

1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，可導致胰腺內β細胞的破壞[21]。目前的治療方法是希望通過植入免疫分離的微囊化胰島(稱為生物人工胰腺)來替代丟失的β細胞團。這種方法的目標是在不需要免疫抑制劑的情況下恢復血糖調節。胰島具有高度的代謝活性，正常功能狀態下需要大量的氧氣，為了防止胰島缺氧損傷，在血管重建發生前(通常在移植后5～10 d), 需要持續供氧[22]。一種以膠原為基礎的CPO低溫生物支架氧氣釋放可持續21 d, 與單獨的低溫生物支架植入胰島相比，植入到低溫CPO生物支架中的胰島具有更高的生存能力和功能，將同基因胰島移植到糖尿病小鼠附睪脂肪墊(EFP)中，結果顯示CPO生物支架可改善胰島功能，使糖尿病小鼠恢復血糖控制[23]。此外，有研究將CPO-聚二甲基硅氧烷復合物共培養的胰島移植到糖尿病大鼠模型中，探索補充氧合對體內細胞功能的影響。移植結果顯示，與含釋氧復合物共培養胰島的移植物有效性顯著改善。這些結果證明了釋氧材料可減輕胰島在培養過程中有害缺氧誘導途徑激活的效力，并強調了原位產氧對產生的胰島移植結果的重要性[24]。

2.3 心血管組織工程

血管損傷導致的缺氧是細胞治療成功的主要限制因素，移植細胞要存活，必須有足夠的營養和氧氣供應。有研究通過疏水材料PCL復合CPO降低了過氧化氫濃度并延長了氧氣生成的時間，原位氧張力的提高使植入細胞能夠持續產生大量的血管生成因子，并提供一個代謝保護的促血管生成微環境，活組織的釋氧作用也有效地協調植入組織的快速全層血管化[25]。

此外心肌梗死可引起心肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞的大量死亡。梗死區氧含量極低是死亡的主要原因，心肌梗死還可引起嚴重的致病性炎癥反應、瘢痕形成和心功能下降[26]。保護心臟細胞和促進心臟修復是治療心肌梗死的關鍵目標[27]。通過電噴霧法制備的以PLGA為殼層、PVP/H2O2為核層的核殼結構微球與熱敏水凝膠混合，能在4周內持續釋放氧氣。在缺氧條件下，人臍靜脈內皮細胞、心臟成纖維細胞和心肌細胞分別與可釋放氧氣的微球-水凝膠復合系統、單純水凝膠培養，結果顯示可釋放氧氣的微球-水凝膠復合系統中3種細胞的存活數量顯著多于單純水凝膠組[28]。

2.4 皮膚傷口愈合

皮膚中的彈性纖維由成纖維細胞合成，參與傷口愈合。彈性蛋白來源于一種可溶性前體—原彈性蛋白，主要由纖維蛋白-1和-2組成。彈性蛋白在特定酶賴氨酰氧化酶(LOXs)作用后交聯，與微纖絲結合，產生的纖維對環境壓力、抗張強度和壓縮具有極強的抵抗力，研究[29]表明缺氧會影響原彈性蛋白和LOX的表達，破壞愈合過程中的纖維合成彈性。為了加強皮膚傷口的愈合，一種含有SPC的PLGA薄膜在24 h內，可以觀察到氧氣從薄膜中釋放出來。當產氧生物材料與小鼠缺血組織接觸后，可觀察到組織壞死和細胞凋亡減少，這表明，使用產氧生物材料可以維持數天的組織活力[30]。糖尿病創面具有多種病理生理變化，治療難度較大。缺氧是糖尿病創面血管化不良和慢性愈合的主要原因之一。ZEHRA M等[13]以PCL為基礎加入SPC研制的釋氧靜電紡絲創面敷料。實驗結果表明，研制的敷料能夠連續產氧，覆蓋了PCL/SPC敷料的創面具有相對更好的血管化和愈合。

2.5 肌肉再生

臨床上長時間缺血、缺氧可導致肌肉和組織壞死，而為創傷缺血后的缺氧肌肉補充氧仍然是一個重大的醫學挑戰，對組織搶救、修復和再生具有重要意義。LYU X G等[31]開發了絲素蛋白/角蛋白/明膠/CPO薄膜，良好的力學性能、無細胞毒性、抗菌作用，支架能夠在體外2周內有穩定的氧氣釋放。與不含CPO的薄膜相比，含CPO的薄膜顯示兔平滑肌細胞生長和活力改善。體內實驗采用狗尿道缺損模型證明了CPO膜治療動物上皮細胞層和組織肌束的形成。有研究[32]制備了含有SPC的可注射生物材料，直接注射到大鼠骨骼肌，結果顯示可以部分維持缺氧條件下靜止的骨骼肌穩態。

2.6 抗菌

生物材料不僅需要能夠促進健康的組織整合，還需要能夠同時抵抗細菌定植和由此引起的相關感染。在口腔科, 3%的過氧化氫溶液主要用于促進牙齦手術后的恢復，減少牙菌斑以及與牙周病有關的微生物水平，其抗菌機制是被催化劑(如過氧化氫酶)分解后釋放氧氣，在氧氣存在的情況下厭氧菌存活率下降[33]。CaO2球形聚集體表現出優異的破傷風桿菌、具核梭桿菌、大腸桿菌等抗厭氧菌活性[34]。SOFOKLEOUS P等[35]將過碳酸鈉與乙酰供體(四乙酰乙二胺)結合，可快速且持續地殺死耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐碳青霉烯大腸桿菌。有研究采用靜電紡絲技術制備了不同比例的過氧化鈣(1%、5%和10%)加入或不加入抗壞血酸的PCL納米纖維。抗菌評價證實了納米纖維對大腸桿菌和表皮葡萄球菌生長的抑制特性[36]。ABUDULA T等[37]成功制備了由聚癸二酸甘油酯(PGS)/PCL聚合物和CPO納米粒子組成的釋氧支架，通過紙片擴散法證明該支架能有效抑制與外科感染相關的金黃色葡萄球菌活性。因此過氧化物有希望應用于抗菌感染(尤其是用于厭氧菌感染)局部生物應用。

2.7 腫瘤治療

大多數實體腫瘤中存在低氧腫瘤細胞，會引起對輻射照射的耐藥性，降低放療效果，導致治療失敗、復發和轉移[38-39]。有文獻報道了一種以中空介孔二氧化硅納米顆粒(HMSNs)為載體，在HMSNs的通道和空腔中合成SPC, 并涂覆聚丙烯酸(PAA)的氧輸送功能材料。該材料誘導大量活性氧自由基產生殺死癌細胞，效果顯著。同時，單獨應用SPC-HMSNs-PAA時未見明顯的細胞毒性[40]。化學動力學療法(CDT), 通過芬頓或類似芬頓的反應將H2O2轉化為一種劇毒的羥基自由基(OH), 以殺死癌細胞，使選擇性腫瘤治療成為可能[41]。但由于癌細胞內源性H2O2不足，其作用受到嚴重限制。同時，表位印跡的特異性識別在靶向癌細胞標記物方面也發揮著重要作用[42]。有研究制備了H2O2自給可降解的分子印跡聚合物(MIP)用于有效的CDT, 采用熒光過氧化鈣(FCaO2)作為成像探針和H2O2來源, CD47胞外區暴露的肽作為模板，丙烯酸銅作為功能單體之一。具有識別位點的MIP可以特異性靶向CD47陽性癌細胞，實現熒光成像。在微酸性環境下，在谷胱甘肽(GSH)還原作用下, MIP被降解，暴露的FCaO2與水反應，不斷產生H2O2。自供的H2O2通過MIP框架內銅離子介導的類似芬頓的催化反應產生OH, 誘導癌細胞凋亡。因此, MIP納米平臺能夠特異性識別癌細胞標志物, H2O2自給和可控治療，成功用于靶向CDT[43], 為體外精確靶向和強化治療提供了新方法。

3 總結與展望

目前，組織工程技術研究取得很大進展，但是在修復大尺寸創傷或缺損時仍存在一些難點需解決: 組織工程支架除了必須具有一定的機械強度、良好的生物相容性和生物可降解性外，還應模擬生物微環境; 移植后如何保持細胞活性; 移植后由于血管生成和血管化不適當或不足而出現供氧不足，導致細胞凋亡和組織壞死[44-46]。充足的氧氣供應對細胞生存和生長至關重要，因此開發長效釋氧支架有可能克服組織工程應用中氧氣供應短缺的問題。

氧釋放支架的主要目標是為細胞代謝提供更好的環境，提高組織工程效果、缺血組織愈合和組織再生。有研究選擇過氧化物作為產氧源，采用PCL、PLGA和GelMA等多種生物材料作為載體，制備成薄膜、微球、凝膠等形式，控制過氧化物的反應速率，延長氧氣釋放時間，實現氧氣的持續釋放，并且實驗也證明了釋氧支架在最初的幾天和幾周內可促進細胞分化和組織再生，但是觀察氧氣釋放曲線時仍可發現在釋放初期存在突釋現象。所以加入過氧化氫酶或MnO2可以有效減少羥基自由基的產生，降低細胞毒性。也有研究利用過氧化物的分解產物來實現抗菌效果、抑制癌細胞。總的來說，過氧化物結合高分子生物可降解生物材料在骨再生、胰島移植、心血管組織工程、肌肉再生、傷口愈合、抗菌和腫瘤治療應用中得到了廣泛的研究，因此氧釋放生物材料對于藥物輸送、防止細胞死亡和組織感染，促進組織修復，具有較好的應用前景。

目前，釋氧生物材料的應用范圍有限，這可能是因為過氧化物分解后存在突釋、難以提供長期控釋，并且難以根據預期的應用將載體材料的降解速率和氧氣釋放曲線進行調整。因此選擇合適的氧源、載體材料、釋放控制方法是有助于實現臨床轉化的必要條件。如何制備高效的功能化的氧釋放生物材料，以實現合理調控氧氣釋放的時間及釋放量等還需解決的問題。