水楊酰芳胺衍生物通過抑制STAT-3對肝癌HepG-2細胞的影響

胡敏華 邾枝花

我國是乙型肝炎病毒感染的高發區，也是肝癌發病的高發區[1-2]。由于肝癌早期無明顯臨床癥狀，肝癌患者一旦發現病情發展都處于中晚期，化療是中晚期肝癌治療的主要方式，目前應用于治療肝癌的靶向藥主要有索拉非尼（Sorafenib ）、侖伐替尼（Lenvatinib）及納武單抗（nivolumab），以上靶向藥主要的靶點是EGFR、VEGFR、PDGFR-α等。隨著時間的推移，目前治療肝癌的靶向藥耐藥性也逐漸顯現，針對新靶點肝癌治療藥物的研發迫在眉睫。

信號轉導及轉錄激活因子3（STAT-3）可能與肝癌的發生早期階段有一定關系，同時STAT的過度表達與肝癌的病理分期呈正相關性，阻斷STAT-3的磷酸化可發揮抑制肝癌晚期腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，從而影響肝癌患者的預后及生存期。STAT-3是STAT家族中的重要一員，STAT-3也是與腫瘤的發生和發展關系最密切的轉錄因子之一[3-4]。肝癌作為致死率較高的癌種，其與STAT-3過度活化之間的相關性也引起了越來越多研究者的關注[5]。筆者前期實驗也證實了水楊酰芳胺衍生物N-（3-氯-4-氟苯基）-2-羥基-4-（3-（哌啶-1-基）丙氧基）苯甲酰胺（NPBM）和N-（3-氯-4-氟苯基）-2-羥基-4-（3-嗎啉丙氧基）苯甲酰胺（NMBM）對表皮鱗癌A431細胞和肺腺癌A549細胞的增殖具有不同程度的抑制作用，且能通過抑制腫瘤細胞中表皮生長因子受體（EGFR）活性及STAT-3發揮抗腫瘤活性[6]，因此本試驗擬研究化合物NPBM和NMBM對肝癌HepG-2細胞中STAT-3的影響，期望合成化合物通過作用于STAT-3發揮抗肝癌的作用，研究出新靶點的抗肝癌靶向制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器 CP225D萬分之一電子天平（Sartorious）；ZF-7三用紫外燈（上海嘉鵬科技有限公司）；SCV-4A1垂直流超凈臺（新加坡藝思高科技有限公司）；Thermo 3111型CO2培養箱（美國Therm-Electron公司）；Eclipse TS100-FDH1型倒置光學顯微鏡（日本 Nikon公司）Spectramax M2e 多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；Mini PROTEAN 3 電泳及轉膜裝置（美國 BIO-RAD公司）。

1.1.2 藥品與試劑 化合物NPBM、化合物NMBM（實驗室合成經四大光譜確證結構）；氯硝柳胺（安徽東盛制藥有限公司生產）；STAT-3、phosphor-STAT-3、Jak、Bcl-2、兔抗人Stat-3 抗體（一抗）及FITC標記羊抗兔IgG（二抗）均購自武漢博士德生物技術有限公司；培養液DMEM及McCoy's 5a、0.25%胰蛋白酶、PBS及DMSO購自上海吉諾醫藥生物技術有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；細胞固定用多聚甲醛由本實驗室自行配制。

1.1.3 細胞 人肝癌HepG-2細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測化合物對肝癌細胞HepG-2增殖活性的影響 采用MTT法檢測化合物NPBM和NMBM在不同濃度對肝癌細胞HepG-2的影響，并選用氯硝柳胺作為陽性對照藥。取對數生長期的肝癌細胞HepG-2，分別以2×104個/mL細胞密度接種于96孔培養板中，100 μL/孔，每種細胞各種4塊板。置于37 ℃，5% CO2孵箱內培養12 h。吸棄上清液，然后分別加入200 μL不同濃度的NPBM、NMBM。同時設陽性對照藥組和不含藥物的細胞對照組，每組設4個復孔。培養24 h后，再加入5 mg/mL的MTT 20 μL/孔，繼續培養4 h后吸棄上清，加入DMSO 150 μL/孔，微振蕩器上振蕩10 min，將試劑對照調零，用自動酶標儀在570 nm波長處測出細胞對照組和各藥物組的OD值，取各組均值，重復實驗3次。以下面的公式計算各組藥物對細胞的抑制率IR=（1-藥物組OD值/細胞對照組OD值）×100%，同時計算IC50值。

1.2.2 熒光免疫試驗 取對數生長期肝癌細胞HepG-2于24孔板中培養（約5×103/孔），培養24～48 h后（70%匯合度），加入預先配置好的不同濃度待測藥物（1.0×10-4，3.3×10-5及1.0×10-5mol/L），經孵育24 h后，棄培養液，多聚甲醛溶液室溫固定細胞15 min，PBS洗凈后加入致孔劑Triton 100（濃度為0.3%），室溫靜置30 min，PBS洗凈后封閉液（10%山羊血清）覆蓋標本表面37 ℃孵育1 h，洗凈后加一抗4 ℃孵育過夜，第2天37 ℃復溫1 h，FITC標記二抗以合適濃度稀釋于PBS，覆蓋標本表面，37 ℃避光孵育1 h，加DAPI熒光試劑核染，5 min后PBS潤洗三遍，于熒光顯微鏡下拍照記錄。通過CCD成像系統讀取綠色部分熒光強度。

1.3 統計學分析 采用SPSS 17統計軟件處理數據，多組間數據進行比較采用單因素方差（ANOVA）進行分析，實驗數據進行比較，以P＜0.05為差異有顯著性意義。利用Graph- Pad Prism 5.0軟件進行實驗數據相關圖形的繪制。

2 結 果

2.1 化合物NPBM和NMBM對HepG-2肝癌細胞增殖活性影響情況 MTT法顯示不同濃度化合物NPBM和NMBM及陽性對照藥氯硝柳胺對肝癌細胞HepG-2的影響，結果如圖1所示，不同濃度化合物NPBM和NMBM（1.56，3.12，6.25，12.5，25，50和100μmol/L）對肝癌HepG-2細胞的增殖均具有不用程度的抑制作用。氯硝柳胺、化合物NPBM和NMBM對HepG-2細胞logC分別為-4.627、-4.092、-4.314。

圖1 化合物NPBM和NMBM對HepG-2的影響

2.2 化合物NPBM和NMBM對HepG-2肝癌細胞STAT-3表達的影響 熒光免疫實驗顯示化合物NPBM和NMBM對HepG-2肝癌細胞中STAT-3的表達具有一定的抑制作用（見圖2），其中化 合 物NPBM濃 度 為10-4mol/L、3.3×10-5mol/L及10-5mol/L對HepG-2肝 癌 細 胞 中STAT-3表達總量均具有顯著抑制作用，化合物NMBM濃度 為10-4mol/L及10-5mol/L對HepG-2肝 癌 細 胞中STAT-3表達總量具有輕度抑制作用，化合物NMBM濃度3.3×10-5mol/L對HepG-2肝癌細胞中STAT-3表達總量無抑制作用。

圖2 化合物NPBM和NMBM對HepG-2肝癌細胞STAT-3表達的影響

3 討 論

STAT-3蛋白與多種腫瘤的關系極為密切，STAT-3蛋白在超過70%的人類腫瘤中呈過度活化，主要通過調控促癌相關基因參與腫瘤細胞的異常增殖、侵襲轉移、血管生成和免疫逃逸等過程[7-8]。近年來有研究表明，STAT-3可能與肝癌的發生早期階段有一定關系，同時STAT的過度表達與肝癌的病理分期也呈正相關，阻斷STAT-3的磷酸化可發揮抑制肝癌晚期腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，從而影響肝癌患者的預后及生存期[9]。

基于以上研究背景，本研究選取了前期合成的化合物NPBM和NMBM作用于HepG-2肝癌細胞，結果顯示化合物NPBM和NMBM能夠抑制HepG-2肝癌細胞的增殖，同時不同濃度的化合物NPBM對HepG-2肝癌細胞中STAT-3表達總量均具有顯著抑制作用，化合物NMBM對HepG-2肝癌細胞中STAT-3表達總量抑制作用較輕。

綜上所述，化合物NPBM和NMBM能夠抑制肝癌細胞，作用機制可能與抑制STAT-3信號通路有關。