青藤堿調控Nrf2/Keap1信號通路對膿毒癥急性肺損傷的改善作用

王慧 龔園其 周儀華 藍海兵 張嘯

南昌大學第二附屬醫院重癥醫學科（南昌 330000）

膿毒癥是一種主要由細菌、病毒或真菌所引發全身炎癥反應的疾病，是ICU 患者最常見的死亡病因之一［1］。該病常累及肺臟、腎臟等損傷，進而造成多器官出現功能障礙，這是其病死率居高不下的重要因素［2］。隨著膿毒癥加重，大量炎癥介質釋放，進而刺激中性粒細胞聚集與活化，導致肺泡內皮細胞受損、肺血管通透性增加，從而引起急性肺損傷［3］。所以膿毒癥引起的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是膿毒癥最為常見的并發癥。不同研究均觀察到炎癥反應與肺損傷的關聯性極大，可見探討膿毒癥時將肺損傷作為觀察多器官功能障礙的研究指標具有極高的研究價值［4］。青藤堿（Alkaloid sinomenine，SIN）是從青風藤提取分離出的一種具有較強生物活性的生物堿，現研究表明，青藤堿具有抗腫瘤、抗炎、鎮痛等功效［5］。前文［6］研究證實鹽酸青藤堿能夠減輕膿毒癥小鼠全身炎癥反應，降低小鼠死亡率。但迄今青藤堿對膿毒癥肺損傷的調控作用機制尚不明確。因此，本研究嘗試建立大鼠膿毒癥模型，按照膿毒癥的定義，觀察SIN 對膿毒癥大鼠急性肺損傷的影響及對Nrf2/Keap1 信號通路的干預作用，為SIN 的抗炎作用進一步提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物60 只SPF 級SD 大鼠，雄性，6月齡，平均（180 ± 20）g（廣州賽思思生物科技有限公司）。經南昌大學實驗動物科學中心動物實驗倫理審查通過（批準號：ACU18?392）

1.1.2 試劑SOD、MDA 含量檢測試劑盒（產品貨號：AK060、KTB1050，北京冬歌博業生物科技有限公司）；IL?1β、TNF?α、IL?6 試劑盒（產品貨號：EK0445、EK0497、EK0499，上海和序生物科技有限公司）；甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）、Nrf2、Keap1、HO?1及二抗均購自美國Cell Signaling Technology 中國公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的建立及分組給藥參照文獻［7］采用盲腸結扎穿孔手術建立大鼠膿毒癥ALI 模型。將60 只SD 大鼠隨機分成ALI 組、假手術組、SIN 組（40?SIN 組、80?SIN 組、160?SIN 組），每組12 只。所有大鼠均以10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，約2～5 min 后檢查大鼠麻醉程度后，將已徹底麻醉好的大鼠仰臥固定于操作臺，清理腹部皮毛，碘酒消毒大鼠下腹并切約1.5 cm 切口，剪開腹膜，顯露盲腸。然后，將盲腸1/3 處用縫合線結

扎后，用針頭對穿結扎中部位置。完成后將盲腸收納回腹腔，逐層關閉腹腔并進行消毒處理。假手術組大鼠在取出盲腸后不做結扎穿刺處理，暴露盲腸后直接將其回納至腹腔內。SIN 組術后立即給予不同劑量（40、80、160 mg/kg）SIN 尾靜脈注射給藥，每天17：00～19：00 固定時間給藥，連續3 d。

1.2.2 肺組織的采集末次給藥結束后1 h，將大鼠麻醉處死，最大程度暴露胸腔且盡量避開肺臟及動脈，以免對肺組織病理切片的觀察造成干擾以及之后指標的檢測存在大量血漬，對各項指標的測定帶來誤差。

1.2.3 肺組織評分結果對取下來的大鼠肺臟進行膿毒癥嚴重程度評分，評分標準參照參考文獻［8］。評分要求雙人同時評分，避免人為誤差，取平均值進行最終計算。

1.2.4 HE 法檢測大鼠肺組織病理損傷取出1.2.2 中左肺，進行常規透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm 的切片后，脫蠟，水化，染色5 min，漂洗2 min，脫水2 min，透明處理，封片，置于顯微鏡下觀察肺組織形態。

1.2.5 檢測大鼠肺組織SOD、MDA 活性水平取另一部分的肺組織按要求制備肺組織勻漿液，以4 000 r/min 離心15 min，分離上清液，按照試劑盒說明書檢測肺組織中SOD、MDA 活性水平。

1.2.6 ELISA 法檢測大鼠肺組織IL?1β、TNF?α、IL?6 含量取1.2.2 中右肺組織置于4 ℃冰箱中解凍后，剪碎，制備組織勻漿液，檢測其中IL?1β、TNF?α、IL?6 水平，具體操作說明書進行。

1.2.7 Western blot 法檢測大鼠肺組織Nrf2、Ke?ap1、HO?1mRNA 蛋白表達取約0.5 g 肺組織制備成勻漿液，4 ℃離心，取上清液測定勻漿液蛋白總濃度。取適量上清液檢測大鼠肺組織Nrf2、Keap1、HO?1 蛋白表達情況。

1.2.8 qRT?PCR 檢測肺組織中Nrf2、Keap1、HO?1mRNA 的表達水平取0.4 mg 的肺組織，裂解提取總mRNA 并測定純度。采用實時熒光定量法檢測大鼠肺組織中Nrf2、Keap1、HO?1mRNA 相對表達量，各引物序列見表1。

表1 Nrf2、Keap1、HO?1mRNA 引物序列Tab.1 Primer sequences of Nrf2，Keap1 and ho?1mrna

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，所有數據以均值±標準差。多組間差異比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織評分的影響與假手術組對比，ALI 組肺組織評分增大（P<0.01）；與ALI 組對比，40?SIN、80?SIN、160?SIN組膿毒癥急性肺損傷的肺組織評分減小（P<0.01），見表2和圖1。

表2 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織評分的影響Tab.2 Effect of sinomenine on lung tissue score of sepsis acute lung injury

圖1 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織評分的影響Fig.1 Effect of sinomenine on lung tissue score of sepsis acute lung injury

2.2 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織氧化指標SOD、MDA 含量的影響與假手術組對比，ALI組肺組織氧化指標SOD 活性減弱，MDA 水平提高（P<0.01）；與ALI 組對比，40?SIN、80?SIN、160?SIN組肺組織氧化指標SOD 活性增強，MDA 水平降低（P<0.01），見表3和圖2。

圖2 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織氧化指標SOD、MDA 含量的影響Fig.2 Effect of sinomenine on the content of SOD and MDA in lung tissue of sepsis acute lung injury

表3 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織氧化指標SOD、MDA 含量的影響Tab.3 Effects of sinomenine on the contents of SOD and MDA in lung tissue of sepsis acute lung injury x±s

2.3 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織IL?1β、TNF?α、IL?6 含量的影響與假手術組對比，ALI組肺組織IL?1β、TNF?α、IL?6 含量提高（P< 0.01）；與ALI 組對比，40?SIN、80?SIN、160?SIN 組肺組織IL?1β、TNF?α、IL?6 含量降低（P< 0.01），見表4和圖3。

圖3 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織IL?1β、TNF?α、IL?6 含量的影響Fig.3 Effect of sinomenine on IL?1 in lung tissue of sepsis acute lung injury β，TNF?α，Effect of IL?6 content

表4 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織IL?1β、TNF?α、IL?6 含量的影響Tab.4 Effects of sinomenine on IL?1 in lung tissue of sepsis acute lung injury β，TNF?α，Effect of IL?6 content x±s

2.4 大鼠肺組織病理切片假手術組大鼠出現少量淤血，但無明顯的病理變化。ALI 組大鼠肺組織出現大量炎性細胞浸潤，大面積的肺泡上皮水腫、變性，肺泡壁與肺泡間隔充血、水腫，氣道管腔內炎性分泌物滲出。與ALI 組比較，40?SIN、80?SIN、160?SIN 組大鼠炎癥程度減輕，但亦有少量巨噬細胞，肺間質水腫稍有，肺組織病理損傷得到了一定的緩解，且呈量?效關系，且高劑量組大鼠肺組織改善病變程度效果最佳，見圖4。

圖4 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織HE 染色病理切片的影響（HE×200）Fig.4 Effect of sinomenine on he stained pathological sections of lung tissue in sepsis with acute lung injury（HE×200）

2.5 Western blot檢測肺組織中Nrf2、Keap1、HO?1蛋白表達水平與假手術組對比，ALI 組大鼠肺組織中蛋白Nrf2、HO?1表達量明顯減少（P<0.01），大鼠肺組織中蛋白Keap1表達量明顯增大（P<0.01）。與ALI 組對比，40?SIN、80?SIN、160?SIN 組肺組織中Nrf2、HO?1表達量明顯增大（P<0.01），大鼠肺組織中Keap1表達量顯著減小（P<0.01），見表5和圖5。

表5 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織中Nrf2、Keap1、HO?1 蛋白表達水平Tab.5 Effects of sinomenine on Nrf2，Keap1 and HO?1 protein expression in lung tissue of sepsis acute lung injury x±s

圖5 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織中Nrf2、Keap1、HO?1、GAPDH 蛋白表達水平Fig.5 Effect of sinomenine on the expression levels of Nrf2，Keap1，HO?1 and GAPDH proteins in lung tissue of sepsis acute lung injury

2.6 qPCR 檢測肺組織中Nrf2、Keap1、HO?1 mRNA表達水平與假手術組對比，顯著下調ALI組大鼠肺組織中蛋白Nrf2、HO?1 mRNA 表達量明顯減少（P<0.01），明顯上調大鼠肺組織中蛋白Keap1 mRNA表達量明顯增大（P<0.01）。與ALI組對比，40?SIN、80?SIN、160?SIN 組肺組織中Nrf2、HO?1 mRNA 表達量明顯增大（P< 0.01），大鼠肺組織中Keap1mRNA 表達量明顯減少（P<0.01），見表6。

表6 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織中Nrf2、Keap1、HO?1 mRNA 表達水平Tab.6 Effects of sinomenine on the expression levels of Nrf2，Keap1 and HO?1 mRNA in lung tissue of sepsis acute lung injury ±s

表6 青藤堿對膿毒癥急性肺損傷的肺組織中Nrf2、Keap1、HO?1 mRNA 表達水平Tab.6 Effects of sinomenine on the expression levels of Nrf2，Keap1 and HO?1 mRNA in lung tissue of sepsis acute lung injury ±s

組別假手術組ALI 組40?SIN 組80?SIN 組160?SIN 組給藥劑量（mg/kg）--40 80 160 Nrf2 mRNA 0.98±0.05 0.54±0.04**0.73±0.05##0.89±0.06##1.35±0.08##Keap1 mRNA 0.97±0.06 5.12±0.25**4.51±0.21##2.59±0.18##2.34±0.19##HO?1 mRNA 1.04±0.1 0.23±0.03**1.09±0.08##1.79±0.12##2.26±0.12##

3 討論

膿毒癥極易發展成膿毒癥急性肺損傷，其發病率為25%～45%；并且膿毒癥合并ALI 患者在臨床上死亡率可高達50%～60%［9］。青藤堿來源于青風藤，其源藥材在《本草綱目》記載其“治風濕流注，歷節鶴膝，麻痹瘙癢，損傷瘡腫，入酒藥中用”。故其對炎癥的功效由來已久。青藤堿對LPS引起的大鼠膿毒癥急性肺損傷具有一定的治療作用［10］，但其治療機制尚不明確。本文針對Nrf2/Keap1 信號通路進行探究，探究青藤堿對膿毒癥引起的急性肺損傷的作用及其機制。

MDA 可以反應氧自由基的活性和數量，提示細胞損傷的程度［11］。SOD 是重要的抗氧化物質，具有抑制氧化應激反應、保護肺組織的作用［12］。IL?1β 和TNF?α 作為機體內最常見的促炎癥因子，而IL?10 釋放可抑制促炎癥因子釋放；TNF?α 能夠引起炎癥細胞聚集，合成并釋放IL?1β，使IL?1β 參與炎癥反應［13］，進而加劇炎癥反應的進程，使炎癥狀況進一步惡化。肺部感染是膿毒癥并發ALI 的危險因素之一［14］；而肺部感染首先會引起炎癥的發生，進而伴隨著氧化應激反應的發生。本研究結果表明，ALI 組大鼠肺臟指標SOD 活性減弱，MDA、IL?1β、TNF?α、IL?6 水平升高，切片結果出現大量炎性細胞浸潤，大面積的肺泡上皮水腫、變性，肺泡壁與肺泡間隔充血、水腫，氣道管腔內炎性分泌物滲出，這都反映了ALI 伴隨著氧化應激過程以及炎癥反應。而與ALI 組對比，青藤堿各組膿毒癥急性肺損傷的肺組織評分減小并且肺組織氧化指標SOD 活性增強，MDA、IL?1β、TNF?α、IL?6 水平降低，這表明青藤堿可通過調節氧化應激水平及緩解炎癥蔓延進程以緩解膿毒癥急性肺損傷。

氧化應激反應與膿毒癥急性肺損傷的發生、發展、轉歸密切相關，是機體內抗氧化應激主要通路之一為Nrf2/Keap1 信號通路。其中，Nrf2 激活后轉移至細胞核，能轉錄編碼各種抗氧化蛋白和代謝酶的基因，能抑制體內大部分的氧化應激反應［15］。作為Nrf2/Keap1信號通路下游靶基因，HO?1具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用［16］。Nrf2是氧化應激調控中的重要轉錄因子，調節抗氧化蛋白表達并抵抗氧化應激損傷［17］。本研究結果表明，青藤堿對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織中明顯上調Nrf2、HO?1蛋白及mRNA表達量，顯著下調大鼠肺組織中Keap1 蛋白及mRNA 表達量，進而調節Nrf2/Keap1信號通路對膿毒癥急性肺損傷有積極性改善。

綜上所述，SIN 通過上調Nrf2、HO?1 蛋白及mRNA 表達量和下調大鼠肺組織中Keap1 蛋白及mRNA 表達量，進而調節Nrf2/Keap1 信號通路，進而緩解ALI 引起炎癥浸潤以及細胞組織損傷程度，保護肺組織，改善膿毒癥引起的急性肺損傷。