基于EP2/ NLRP3 信號通路探討雀啄灸對原發性痛經大鼠的影響

胡 靜 衛 彎 高 慧 徐 剛 楊華元

上海中醫藥大學針灸推拿學院，上海 201203

原發性痛經（primary dysmenorrhea，PD）又稱功能性痛經，是伴隨月經出現的非器質性下腹及腰部痙攣性疼痛，發病率為20%～94%，是困擾全球女性最常見的婦科疾病[1]。艾灸對PD 的臨床近期治愈率達90%[2]，療效顯著且無明顯副作用，雀啄灸作為一種動態懸灸，可提供比溫和灸更強的熱刺激[3]，經臨床驗證對PD 有較好的鎮痛效果[4]。但灸法治療PD 的機制尚不清楚。Nod 樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥體是炎癥反應的核心[5]，研究發現在PD 大鼠子宮中存在NLRP3 異常活化現象[6]。前列腺素E 受體2（prostaglandin E receptor 2，EP2）可通過下游信號通路促進NLRP3 的活化[7-8]，引起下游效應蛋白caspase-1明顯升高，加重炎癥反應。而灸法治療PD 的抗炎機制是否與調控EP2/NLRP3 信號通路有關尚無文獻報道。因此，本研究通過給予EP2 受體激動劑探究雀啄灸對痛經大鼠子宮EP2/NLRP3 信號通路的調控作用，闡明灸法通過抗炎治療PD 的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級雌性SD 大鼠，3 月齡，體重（200±20）g，由上海中醫藥大學動物實驗中心提供，動物合格證號：20180006028619，生產許可證號：SCXK（滬）2018-0006，倫理審查號：PZSHOTCM210604005。將24 只處于動情間期的SD 大鼠按照隨機數字表法分為空白組、模型組、雀啄灸組、激動劑組，每組6 只。

1.2 主要試劑及儀器

苯甲酸雌二醇注射液（寧波第二激素廠，1102525 11）；縮宮素注射液（上海禾豐制藥廠，120302）；Treprostinil（CSNpharm，CSN23716-001）；EP2 一抗（Abcam，Ab236779）；NLRP3 一抗（Bioss，bs-10021R-AF555）；caspase-1 一抗（Bioss，bs-10743R）；廣譜二抗（上海長島生物技術有限公司，D-3004）。光學顯微鏡（OLYM PUS，CH30 型）；恒溫烘箱（上海恒一科學儀器有限公司，DHG-9023A）；石蠟切片機（徠克公司，SQ2125）；顯微圖象分析系統（NIKON 公司，DS-Ri2）。

1.3 造模方法

參考《常用醫藥研究動物模型》[9]建立大鼠PD 模型。除空白組外，其余三組大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇：第1、10 天劑量為0.5 mg/只，第2～9 天劑量為0.2 mg/只。在第10 天，注射苯甲酸雌二醇1 h 后大鼠腹腔注射縮宮素2 U/只。空白組每日注射同等劑量的生理鹽水。注射縮宮素后出現扭體反應作為模型成功的標志[10]。

1.4 治療方法

空白組：每日注射生理鹽水后不進行任何處理；模型組：每日造模后不進行任何處理；雀啄灸組：每日造模后，選取雙側三陰交和關元穴進行雀啄灸治療，每穴15 min，1 次/d，共10 次；激動劑組：每日造模后，腹腔注射Treprostinil（EP2 受體激動劑）30 μg/kg，之后進行雀啄灸治療，治療方法同雀啄灸組。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠扭體次數 造模第10 天，各組大鼠腹腔注射縮宮素后觀察30 min，記錄扭體潛伏時間、扭體次數。

1.5.2 子宮組織HE 染色 各組子宮組織脫蠟水化后，使用蘇木精染色5 min 后，經鹽酸乙醇分色、自來水浸泡后，用伊紅溶液染色2 min，經脫水、樹膠封固后用顯微鏡觀察。

1.5.3 子宮組織免疫組織化學法 每組隨機選3 只檢測EP2、NLRP3、caspase-1 蛋白表達，組織切片浸泡于二甲苯溶液中脫蠟，梯度乙醇浸泡后使用高壓熱修復法修復抗原，經H2O2孵育后用山羊血清封閉1 h，滴加一抗50 μl（稀釋倍數1∶100），過夜孵育后滴加廣譜二抗50 μl（稀釋倍數1∶50），濕盒孵育后滴加ABC 50 μl，再用PBS 沖洗滴加LDAB 100 μl 染色，切片顏色變化時浸泡于蘇木精中，用1%鹽酸酒精組織分色，之后依次置于梯度乙醇、二甲苯中，用中性樹膠封片。

1.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 6 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠扭體反應比較

與空白組比較，模型組大鼠扭體潛伏時間縮短、扭體次數增多（P ＜0.01）；與模型組比較，雀啄灸組潛伏時間延長、扭體次數減少（P ＜0.01）；與雀啄灸組比較，激動劑組潛伏期縮短、扭體次數增多（P ＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠扭體反應比較

2.2 各組大鼠子宮組織HE 染色觀察

空白組子宮組織形態規則，肌細胞間質內少許淋巴細胞，無中性粒細胞浸潤；模型組、激動劑組子宮小血管有擴張及充血表現，淋巴細胞與嗜酸性粒細胞等炎癥細胞呈灶團樣向外浸潤明顯；雀啄灸組間質內充血水腫及炎癥細胞浸潤程度明顯較模型組減輕，肌壁間可見少許炎癥細胞浸潤，僅見少許小血管充血。見圖2。

圖2 各組大鼠子宮組織HE 染色（100×）

2.3 各組大鼠子宮組織中EP2、NLRP3、caspase-1 蛋白表達水平比較

與空白組比較，模型組EP2、NLRP3、caspase-1 蛋白表達升高（P ＜0.01）；與模型組比較，雀啄灸組EP2、NLRP3、caspase-1 蛋白表達降低（P ＜0.01）；與雀啄灸組比較，激動劑組NLRP3、caspase-1 蛋白表達升高（P <0.01），雀啄灸組與激動劑組EP2 蛋白表達比 較，差異無統計學意義（P >0.05）。見圖3～4。

圖3 各組大鼠子宮組織中EP2、NLRP3、caspase-1 蛋白表達水平比較

3 討論

原發性痛經又稱“經行腹痛”，由先天稟賦不足、情志失調、勞傷氣血，外感風寒濕邪使氣血瘀阻胞宮所致[11]。前列腺素是最為公認導致PD 發病的關鍵炎癥介質，其中前列腺素E2與PD 關系十分密切[12-13]。前列腺素E2是體內含量最豐富的類花生酯脂質[14]，能產生廣泛而持久的血管擴張作用和致痛作用。EP2 作為其受體與之結合后促使小血管擴張、增加微血管通透性、吸引中性粒細胞、加速炎癥細胞浸潤，協同其他炎癥介質發揮致炎作用[15-16]。本研究結果顯示，經雀啄灸治療后大鼠痛經反應減輕，EP2 表達下降，子宮間質內充血水腫及炎癥細胞浸潤程度明顯減輕，提示雀啄灸可以降低痛經子宮的炎癥反應產生鎮痛效應，與以往研究結果一致[17]。

圖4 各組大鼠子宮組織中EP2、NLRP3、caspase-1 的蛋白表達（免疫組化染色，200×）

痛經患者促炎細胞因子基因編碼上調，長期處于一種慢性微炎癥狀態[18]，但目前灸法治療PD 的機制研究多集中于子宮微循環、血管活性物質、中樞神經系統等[19-21]，對雀啄灸的研究也局限于熱源移動對粗神經纖維、膠狀質細胞刺激產生鎮痛效應[22]。PD 大鼠子宮NLRP3 炎癥小體識別宿主體內危險信號后被激活[23-24]，而在多種疾病的炎癥反應中EP2 可活化腺苷酸環化酶上cAMP/PKA 活性，激活核因子κB 促進NLRP3 炎癥小體的活化進而激活白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）加重炎癥反應[25-26]。因此，本研究立足于對EP2/NLRP3 的調控探討灸法治療PD 的抗炎機制。本研究結果顯示，給予Treprostinil 后，子宮EP2 含量未發生明顯變化，但NLRP3 及其下游caspase-1含量明顯升高，子宮炎癥細胞浸潤程度有所增加。EP2激動劑可能干預了雀啄灸對NLRP3 炎癥小體通路的抑制作用，與EP2 受體結合后引發其下游腺苷酸環化酶的活化，導致第二信使如環磷酸腺苷、游離鈣離子水平升高，引起蛋白激酶A 活化，進一步激活NLRP3炎癥小體，活化caspase-1，生成成熟的IL-1β，使細胞外信號轉導入細胞內，從而擴張小血管，增加血管通透性使動脈擴張和微血管通透性增加導致局部水腫、疼痛。

本研究以炎癥介質前列腺素受體為切入點，通過觀察EP2、NLRP3 及其下游caspase-1 含量探討雀啄灸的抗炎作用。首次證明了雀啄灸通過調控EP2/NLRP3 信號通路調節痛經大鼠炎癥反應，闡明了雀啄灸治療PD 的抗炎新機制，從不同角度補充了灸法治療PD 的機制研究，為學者探討針灸治療PD 提供新的方法和思路。