扁蓿豆水浸提液對其種子萌發自毒作用研究

張小娟，楊 航，張琪琳，張鵬程，宋建超，魚小軍

（1.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070；2.草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省草業工程實驗室，甘肅 蘭州 730070；4.中—美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

連作障礙指在同一塊土壤中連續栽培同種或同科作物時，即使在正常栽培管理狀況下，也會出現生長勢變弱、產量降低和品質下降的現象［1］，自毒作用是導致連作障礙的一個重要因素［2］。自毒作用是植物通過淋溶、殘體分解和根系分泌物向環境中釋放化學物質，對自身生長發育產生直接或間接抑制作用的現象［3］，普遍存在于植物生長過程中。有研究表明，在高于0.15 g/mL 質量濃度的沙芥（Pugionium cornutum）葉、枝條水浸提液處理下，沙芥種子發芽率、發芽指數、苗高、根長、幼苗鮮質量及干質量均顯著降低［4］。盧紅等［5］的研究表明，隨著廣藿香（Pogostemon cablin）根、莖、葉水浸提液質量濃度升高，廣藿香組培馴化苗的株高、根長和鮮質量均呈逐漸降低趨勢。近年來，關于牧草種植過程中自毒作用的研究逐漸引起領域內學者的重視。有研究表明，在苜蓿（Medicago sativa）人工草地建植過程中，自毒作用引起的連作障礙導致幼苗死亡和產量下降［6］；榮思川等［7］研究發現，5 個苜蓿品種植株浸提液對紫花苜蓿品種甘農3 號種子萌發和幼苗生長具有明顯自毒效應，其效應因苜蓿品種、器官和浸提液質量濃度不同而存在顯著差異；王啟等［8］研究發現，花椒葉浸提液對紫云英萌發和根長的抑制作用隨質量濃度增大而增強。

扁蓿豆（Medicago ruthenica）又名花苜蓿、野苜蓿等，多年生豆科牧草，抗旱、抗寒，蛋白質含量高，適口性好，家畜過量采食不會發生膨脹病，是一種優質的蛋白質飼料［8-10］。有關豆科牧草苜蓿的自毒效應較多，而扁蓿豆在生長過程中是否存在自毒效應的研究未見報道。我們以扁蓿豆種子為受體，研究了扁蓿豆不同部位、不同質量濃度水浸提液對其種子萌發和幼苗生長的影響，旨在明確扁蓿豆是否存在自毒效應，為扁蓿豆的科學種植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為扁蓿豆，植株采集于甘肅農業大學草業學院牧草種質資源圃。采集時先清理扁蓿豆植株周圍枯枝落葉，挖取完整植株，清洗根系表面土壤及清除地上枝條間雜物。自然風干后分為地上部分和根系部分，粉碎后用自封袋封裝，于4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 浸提液制備 分別稱取10 g 地上部分和10 g 根系干粉，分別置于150 mL 燒杯中，加入約80 mL 蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，用蒸餾水少量多次沖洗干凈燒杯內壁。編號后封口，置于冰箱冷藏浸泡48 h 后過濾定容至100 mL，即為質量濃度0.10 g/mL 的扁蓿豆地上部分與根系水浸提液。利用逐步稀釋法分別將扁蓿豆地上部分和根系的0.10 g/mL 母液稀釋至質量濃度為0.001、0.025、0.050、0.100 g/mL 的水浸提液［11-13］。

1.2.2 種子發芽實驗 選取籽粒飽滿的扁蓿豆種子，將種皮用砂紙打磨以打破其休眠。采用培養皿紙上發芽法，在直徑9 cm 的一次性培養皿中鋪2 層濾紙，每個培養皿均勻擺放30 粒種子，用0.001、0.025、0.050、0.100g/mL 的地上部分和根系水浸提液分別將種子完全浸沒，每個處理3 次重復，以蒸餾水為對照（CK）。加蓋后置于24 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗的光照培養箱中，每天定時加入適量浸提液保證濾紙濕潤。

1.3 指標測定

以胚芽突破種皮1～2 mm 為發芽標準，每日記錄種子發芽數。日發芽種子數達到最高峰時計算發芽勢。連續3 d 種子萌發總數不變時計算發芽率。試驗7 d 后連續3 d 無種子萌發，故第10 d 為末次計數時間。發芽第10 d 時每皿隨機取10 株幼苗，在坐標紙上測胚芽和胚根長，并稱量單株鮮質量。

式中，SH為單日種子發芽達到最高峰時種子發芽粒數，SE為試驗發芽種子數，ST為試驗總種子數［14］。

式中，Gt為發芽日數，Gt為與Dt相對應的每天發芽種子數。

參照Williamson 等［15］的方法，計算化感作用效益指數（RI）：

式中，T 為測試項目的處理值，C 為對照值。當RI＞0 時，表示存在促進效應；當RI＜0 時，表示存在抑制效應。

1.4 數據分析

采用Excel 2016 軟件對數據進行整理和作圖，用SPSS 19.0 進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和數據處理。

2 結果與分析

2.1 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子萌發及幼苗生長的影響

2.1.1 種子發芽勢 由圖1 可知，隨著地上部分水浸提液質量濃度的增加，扁蓿豆種子發芽勢呈降低趨勢。在0.050 g/mL 質量濃度處理下，發芽勢較對照蒸餾水（CK）降低9.41%；發芽勢在0.100 g/mL 質量濃度下最低，較CK 降低50.38%（P ＜0.05）。在根部水浸提液處理下，扁蓿豆種子發芽勢在0.001、0.050 g/mL 質量濃度處理下，分別較CK 增加3.48%、3.17%，在0.100 g/mL 質量濃度處理下，較CK 顯著降低11.26%（P＜0.05）。

圖1 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子發芽勢的影響

2.1.2 種子發芽率 由圖2 可知，扁蓿豆地上部分水浸提液在0.001、0.025、0.050 g/mL 質量濃度處理下與CK 無顯著差異，0.100 g/mL 質量濃度下發芽率最低，較CK 降低了39%（P＜0.05）。隨著根部水浸提液質量濃度的提高，扁蓿豆種子發芽率呈先增后降的趨勢，0.100 g/mL 質量濃度處理下較CK 顯著降低了11%（P＜0.05）。

圖2 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子發芽率的影響

2.1.3 種子發芽指數 扁蓿豆地上部分和根系水浸提液不同程度影響其種子發芽指數（圖3）。地上部分水浸提液處理下，隨著質量濃度的增加，扁蓿豆種子發芽指數呈先增加后降低的趨勢，在0.050、0.100 g/mL 質量濃度處理下，扁蓿豆發芽指數分別較CK 顯著降低了46.00%、82.00%（P ＜0.05）；根部水浸提液0.100g/mL 質量濃度處理下，扁蓿豆種子發芽指數較CK 顯著降低了21.00%（P＜0.05）。

圖3 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對種子發芽指數的影響

2.1.4 胚芽長 由圖4 可知，扁蓿豆植株地上部分水浸提液對扁蓿豆幼苗胚芽長呈低質量濃度促進、高質量濃度抑制現象。0.001 g/mL 質量濃度處理對扁蓿豆幼苗胚芽生長有顯著的促進作用，較CK 增加了28.00%（P ＜0.05）；在0.050 和0.100 g/mL 質量濃度處理下，胚芽長分別較CK 降低10.59%、56.00%（P ＜0.05）。扁蓿豆根部水浸提液對扁蓿豆幼苗胚芽的生長同樣表現出“低促高抑”效應。在0.001 g/mL 質量濃度處理下，胚芽長較CK 顯著增加了12.20%（P＜0.05）；在0.050、0.100 g/mL 質量濃度處理下，均表現為抑制效應，較CK分別顯著降低12.20%、25.90%（P＜0.05）。

圖4 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其胚芽長的影響

2.1.5 胚根長 由圖5 可知，隨著扁蓿豆地上部分水提液質量濃度的增加，扁蓿豆胚根長呈先增加后降低的趨勢。0.001 g/mL 質量濃度處理的促長效果最顯著，較CK 增加了26.00%（P ＜0.05）；0.100 g/mL 質量濃度處理的抑制效果最顯著，較CK 降低了37.00%（P ＜0.05）。扁蓿豆根部水浸提液對其胚根的伸長也呈現“低促高抑”效應現象，0.001 g/mL 質量濃度處理的促進效果顯著，較CK增加33.00%（P ＜0.05）；0.100 g/mL 質量濃度處理下抑制效果顯著，較CK 降低50.00%（P＜0.05）。

圖5 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其胚根長的影響

2.1.6 單株鮮質量 扁蓿豆地上部分和根系水浸提液亦會影響其幼苗單株鮮質量（圖6）。扁蓿豆幼苗單株鮮質量隨著扁蓿豆地上部分水浸提液質量濃度的增大呈現先升高后降低趨勢，0.001、0.025、0.050 g/mL 質量濃度處理下幼苗單株鮮質量較CK 分別增加了43.28%、31.74%、31.26%（P＜0.05）；根部水浸提液處理下，0.100 g/mL 質量濃度處理的扁蓿豆幼苗單株鮮質量最小，較CK 顯著降低49.49%（P＜0.05）。

圖6 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其單株鮮質量的影響

2.2 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對化感指數的影響

2.2.1 種子發芽勢 由圖7 可知，扁蓿豆植株地上部分水浸提液對扁蓿豆種子發芽勢均表現為抑制效應（RI＜0），且抑制效應隨著質量濃度的增加而增強，0.100 g/mL 質量濃度處理下抑制作用最大，化感效應指數為-0.55。扁蓿豆根部水浸提液對扁蓿豆種子發芽勢抑制作用較地上部分水浸提液抑制作用小，且在根部水浸提液質量濃度為0.001、0.050 g/mL 質量濃度處理下表現為促進發芽效應（RI ＞0），質量濃度為0.100 g/mL 時則表現為抑制效應。

圖7 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子發芽勢化感指數的影響

2.2.2 種子發芽率 由圖8 可知，質量濃度0.001、0.050 g/mL 和0.100 g/mL 的扁蓿豆地上部分水浸提液處理對種子發芽率呈現抑制效應，質量濃度為0.100 g/mL 時抑制效果最明顯，RI=-0.41。根部水浸提液在質量濃度為0.001 g/mL 時對扁蓿豆種子發芽率表現為促進作用，質量濃度為0.100 g/mL時表現為抑制效應。

圖8 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子發芽率化感指數的影響

2.2.3 種子發芽指數 由圖9 可知，0.001 g/mL 質量濃度扁蓿豆地上部分水浸提液處理對種子發芽指數呈正效應，在0.025、0.050、0.100 g/mL 質量濃度的地上部分水浸提液處理均對種子發芽指數呈現負效應。根部水提液在0.001、0.025、0.050 g/mL 質量濃度下對種子發芽指數均呈現正效應，在0.100 g/mL 質量濃度處理下表現為負效應。

圖9 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子發芽指數化感指數的影響

2.2.4 胚芽長 由圖10 可知，扁蓿豆地上部分水浸提液對胚芽長化感指數也存在低質量濃度促進高質量濃度抑制現象。在質量濃度為0.001 g/mL處理下化感指數為0.21，表現為正效應；質量濃度為0.050、0.100 g/mL 處理下化感指數為負，表現為抑制效應。扁蓿豆根部水浸提液在0.001 g/mL的質量濃度處理下對胚芽長有促進效應，在0.025、0.050、0.100 g/mL 質量濃度下均對胚芽長的伸長產生負效應。

圖10 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對胚芽長化感指數的影響

2.2.5 胚根長 由圖11 可知，在扁蓿豆地上部分水提液0.001、0.025、0.050 g/mL 質量濃度處理下，扁蓿豆胚根長表現出正效應，且隨著質量濃度增大正效應逐漸減小；地上部分水浸提液質量濃度為0.100 g/mL 時表現為抑制作用，RI=-0.37。根部水浸提液在質量濃度為0.001、0.025 g/mL 時對胚根的伸長有促進作用；質量濃度為0.001 g/mL時促進作用最大，RI=0.25；質量濃度為0.100 g/mL 時RI 為0.50。

圖11 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其胚根長化感指數的影響

2.2.6 單株鮮質量 由圖12 可知，扁蓿豆地上部分水浸提液在0.001、0.025、0.050 g/mL 質量濃度處理下對幼苗單株鮮質量呈現正效應；在0.100 g/mL質量濃度處理下呈負效應，RI 值為-0.19。扁蓿豆根部水浸提液處理下，在0.100 g/mL 質量濃度處理下化感負效用明顯，RI 值為-0.50。

圖12 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其單株鮮質量化感指數的影響

3 結論與討論

扁蓿豆植株地上部分與根部水浸提液在高濃度下對其種子發芽率，發芽勢，發芽指數，胚根長，胚芽長和單株鮮質量具有一定的抑制作用，總體表現為0.100 g/mL 質量濃度下抑制作用最強。扁蓿豆地上部分水浸提液處理在0.100 g/mL 質量濃度下，種子發芽率較對照蒸餾水顯著降低了39.00%，種子發芽指數較對照蒸餾水降低了82.00%；根部水浸提液在0.100 g/mL 質量濃度下胚根長較對照蒸餾水顯著降低了50.00%。在低濃度下對其種子發芽率，發芽勢，胚根長，胚芽長，和單株鮮重有一定的促進作用，具體表現為0.001 g/mL 質量濃度處理下，對扁蓿豆幼苗胚芽生長有顯著的促進作用；較對照蒸餾水增加了28.00%；在0.001 g/mL 質量濃度處理下對胚根長促進效果顯著，較對照蒸餾水增加了33.00%。總體表現為低質量濃度促進高質量濃度抑制效應。

在植株生長過程中，常有地上部分枯枝落葉，植物果實和殘茬分解物等伴隨降水或人為灌溉等途徑進入植物生長環境中，進而不同程度的影響自身植物生長發育［16］。自毒作用是植物種內競爭的一種特殊機制［17］，當自毒物質的含量達到一定程度或超過某一限值就會產生自毒效應［18］。種子萌發期和胚芽胚根伸長期是對外界脅迫較為敏感的時期［19］，良好的種子萌發率是植物適應環境的先決條件［20］。本研究表明，隨著扁蓿豆植株地上部分和根部水浸提液質量濃度的增加，對扁蓿豆種子發芽勢，發芽率存在不同程度的“低促高抑”現象，這可能是自毒物質影響了α 淀粉酶的活性，從而使得種子可溶性糖合成受到影響，影響了種子發芽勢和發芽率［12］，本試驗結果與王希等［21］在異齡苜蓿水浸液對其種子萌發的自毒效應的研究相似。本試驗中，地上部分水浸提液對種子發芽率和發芽勢的化感指數在高質量濃度下抑制效果高于根部水浸提液，在0.100 g/mL 質量濃度地上部分水浸提液處理下發芽率顯著降低了11.00%，這與汪玲玲等［22］在鐵棒錘地上部分水浸提液對早熟禾發芽率的研究一致。在0.100 g/mL 質量濃度處理下，地上部分水浸提液處理后扁蓿豆種子發芽勢化感指數為-0.55，而在根部水浸提液處理下發芽勢化感指數為-0.09，這表明扁蓿豆地上部分和根系中存在的自毒物質具有差異性，這與鮑紅春等［4］在沙芥不同部位水浸液自毒作用研究的結論相似。

本研究過程中發現，地上部分水浸提液處理下扁蓿豆種子萌發在前7 天中呈現均勻增加趨勢，但根部水浸提液處理下扁蓿豆種子在前3 天發芽數迅速增加，后期出現增加緩慢甚至不增加的趨勢，而試驗數據也表明，在0.050 g/mL 地上部分水浸提液處理下發芽率與對照蒸餾水無顯著差異，而發芽指數顯著低于對照蒸餾水。

在本試驗中，胚芽長和胚根長在扁蓿豆地上部分和根系水浸液下處理下均隨著質量濃度升高呈現先增高后下降趨勢。胚芽長化感指數表明，地上部分水浸提液在0.001、0.025 g/mL 質量濃度處理下表現為正效應，在0.050、0.100 g/mL 處理下對胚芽長表現為負效應，而根部水浸提液處理下在0.025、0.050、0.100 g/mL 質量濃度下表現為負效應。這說明扁蓿豆胚芽長對根部水浸提液中自毒作用的響應更為敏感，在較低質量濃度時表現出了抑制效應。在胚根長化感指數中也出現了同樣的現象，一方面說明扁蓿豆不同部位中自毒物質具有差異性，另一方面也說明扁蓿豆幼苗不同部位對水浸提液的響應敏感程度不同。扁蓿豆不同部位水浸提液會影響其種子萌發和幼苗生長，證明扁蓿豆存在自毒作用。但植物自毒作用是一個復雜的過程，在此基礎上應該進一步研究扁蓿豆水浸提液對幼苗中一些抗氧化酶和滲透調節物質的影響。