降溫速率對蘋果細胞結(jié)構(gòu)的影響

張 哲 吳巧燕 陳佳楠 徐 垚 計宏偉

(天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點實驗室，天津 300134)

應(yīng)用最廣泛的最佳方式的果蔬食材貯運方式是低溫貯藏[1]，在此過程中，細胞組織溫度下降，細胞內(nèi)冰晶體出現(xiàn)、重結(jié)晶發(fā)生，進而給果蔬組織細胞帶來損傷[2]，造成貯藏過程中品質(zhì)劣變，降低營養(yǎng)價值[3]。

國內(nèi)外很多研究人員針對低溫細胞損傷做出大量研究。Meryman等[4]研究冷凍復(fù)溫過程中對細胞的損傷機制，指明細胞外滲透壓會引起細胞變形，復(fù)溫過程現(xiàn)象與降溫過程逆過程類似，水分向外滲透對細胞產(chǎn)生損傷。晏紹慶等[5]分析馬鈴薯在速凍下對其細胞結(jié)構(gòu)的影響，指出速凍導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)嚴重受損,降低了馬鈴薯片質(zhì)地。黎繼烈等[6]指出板栗凍結(jié)緩慢使得冰晶局部集中，造成細胞局部損傷。張哲等[7]研究葡萄冷凍—復(fù)溫過程發(fā)現(xiàn)，復(fù)溫速率越大，復(fù)溫后對細胞的損壞越大。Prestamo等[8]利用光學(xué)顯微鏡研究冷凍下細胞顯微結(jié)構(gòu)的損傷。魯禮明等[9]研究草莓圣女果在不同冷凍下的形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞情況，表明冷凍速率越快，解凍后的蘋果圣女果形態(tài)結(jié)構(gòu)保存越好。劉斌等[10]和王鵬飛等[11]分別研究了不同速凍速率對洋蔥細胞結(jié)構(gòu)、胡蘿卜細胞的影響。Bank[12]對酵母細胞進行快速冷卻，采用冷凍—壓裂技術(shù)觀測細胞的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在遷移過程中酵母細胞從小冰晶體凝聚成重結(jié)晶。劉圣春等[13]研究不同降溫速率下蠶豆細胞結(jié)構(gòu)的變化，慢凍比速凍細胞形態(tài)變化大。趙靜[14]研究表明加大冷凍速率，對葡萄細胞機械損傷小。吳錦鑄等[15]研究荔枝凍結(jié)規(guī)律以提高速凍荔枝商品質(zhì)量。王雅博等[16]研究得出冷卻速率越慢對洋蔥細胞內(nèi)表皮細胞結(jié)構(gòu)造成的機械損傷越大。

試驗旨在從微觀方面研究在溫度載荷下果蔬細胞組織的損傷機理，利用低溫顯微鏡系統(tǒng)觀察降溫速率對細胞變形程度的影響以及細胞內(nèi)部的損傷演變過程，從形態(tài)學(xué)參數(shù)出發(fā)分析蘋果的損傷規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙臺蘋果：無損傷病害、大小一致、新鮮成熟，市售；低溫顯微鏡系統(tǒng)(如圖1所示)：配有用于信息采集、儲存的計算機，BX-43型生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，F(xiàn)DSC196型冷熱臺(英國林克曼科學(xué)儀器公司)，Linksys32溫度控制軟件。

1. CCD照相機 2. 目鏡 3. 物鏡 4. FDSC196型冷熱臺 5. 光源 6. 液氮罐 7. 冷熱臺溫度控制系統(tǒng) 8. 計算機 9. 主機圖1 低溫顯微鏡系統(tǒng)Figure 1 Cryogenic microscope system

1.2 方法

選取新鮮蘋果，剝?nèi)ネ獗砥ぃ瑢⑻O果果肉切成厚度在190～200 μm范圍內(nèi)，在氣密內(nèi)腔樣品室的冷熱臺中放置裝有果肉切片的載玻片，載玻片放置在高導(dǎo)熱的銀質(zhì)加熱元件上。控制系統(tǒng)指令由Linksys32軟件設(shè)定發(fā)出，對腔體溫度變化進行實時跟蹤并調(diào)整。溫度控制由液氮和電加熱絲同時作用，控溫偏差在±0.1 ℃/min，精確控制降溫、升溫速率和某一點溫度點的保持。設(shè)定降溫速率分別為1，2，5，8，10，15，20，50，90 ℃/min。液氮流量是根據(jù)所設(shè)定的降溫速率和蘋果樣品溫度，通過鉑金電阻的反饋計算液氮泵功率進行調(diào)整，液氮泵將液氮壓縮后吹掃內(nèi)腔，調(diào)整螺桿控制樣品在X軸和Y軸移動。對樣品進行觀察分析時，使樣品正好投射到物鏡，可通過目鏡觀察，也利用顯微鏡上的高速攝像機將畫面投到計算機顯示器上，清晰觀察蘋果細胞結(jié)構(gòu)變化，記錄變化時的時間和溫度。采集的微觀細胞圖片用Image Pro-plus 6.0軟件進行處理分析，軟件測量得到細胞的面積與周長。

1.2.1 當(dāng)量直徑及圓度計算 由式(1)、式(2)計算：

(1)

(2)

式中：

d——當(dāng)量直徑，μm；

SR——細胞圓度；

A——細胞面積，μm2；

l——細胞周長，μm。

1.2.2 細胞變形度計算 參照文獻[17]，由式(3)計算細胞變形度。

ε=γa-γb，

(3)

式中：

ε——細胞變形度；

γa——細胞降溫前長短軸之比，μm；

γb——細胞降溫后長短軸之比，μm。

1.2.3 體積及內(nèi)壓計算 由式(4)、式(5)計算：

(4)

(5)

式中：

V——體積，m3；

ΔP——內(nèi)壓，N/m2；

Δl——果蔬細胞周長的變化量，m；

E——果蔬細胞壁彈性模量，取2.67×107N/m2；

R——變形后果蔬細胞的半徑，m；

h——果蔬細胞壁厚度，取1.26×10-6m；

γ——果蔬細胞壁的Possion比，取0.33。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果細胞的冷凍過程研究分析

圖2分別為以1，2，5，8，10，15，20，50，90 ℃/min的降溫速率利用低溫顯微鏡將蘋果細胞從室溫20 ℃降溫到-30 ℃的冷凍過程顯微圖。

由圖2(a)～圖2(e)可知，在1，2，5，8 ℃/min降溫速率下，蘋果細胞出現(xiàn)變形，體積變小。溶質(zhì)損傷和胞內(nèi)冰損失是損傷細胞的兩個主要因素[18]，細胞在比較低的降溫速率下會受到溶質(zhì)損失。慢凍下細胞間隙產(chǎn)生冰晶，冰晶生長擠壓細胞使其變形，隨著冰晶的形成，細胞外部的溶液質(zhì)量摩爾濃度高于細胞內(nèi)部，從而細胞間隙產(chǎn)生高滲透壓。隨著時間的推進，細胞內(nèi)水分通過細胞膜向外流失，導(dǎo)致細胞萎縮。但是未造成細胞破裂，這是因為纖維素、半纖維素等微觀元素的存在，在植物細胞壁中起骨架支撐作用，賦予細胞壁優(yōu)異的韌性和抗拉強度[19]。由圖2(f)～圖2(h)可知，在10，15，20，50，90 ℃/min的5種降溫速率之下，組織細胞未大幅度變形，由于在細胞外和細胞內(nèi)同時達到結(jié)晶條件形成無數(shù)分布均勻小冰晶，平衡了壓力，蘋果細胞的外形特征仍有明顯差別，表現(xiàn)為擠壓細胞間隙，細胞擴張。這與徐茂等[20]在快速凍結(jié)時對烤甘薯生理指標的影響中的結(jié)論一致。

2.2 蘋果細胞的結(jié)晶時間和結(jié)冰溫度

在細胞不斷冷凍下，細胞內(nèi)部冰晶體的瞬間形成產(chǎn)生光的散射現(xiàn)象，導(dǎo)致顯微鏡視野變暗，觀察顯微圖像變暗的點，確定為蘋果細胞的結(jié)冰點。由圖2可知，蘋果細胞在由1 ℃/min降溫速率增大到90 ℃/min的降溫速率時，對應(yīng)凍結(jié)溫度由-16.833 ℃降低到-25.144 ℃，溫度降幅達到49.37%。由圖3可知，對應(yīng)結(jié)冰時間由2 078 s減少到54 s，持續(xù)時間也大大縮短。在較高降溫速率下的蘋果細胞的溫度載荷高于較低降溫速率下的載荷，蘋果細胞過冷度大，相變時間短，迅速形成大量細小的冰晶，釋放潛熱大。但是在較高降溫速率的降溫過程中，較大的溫度載荷使得細胞內(nèi)部水分無法及時滲透到細胞外部[21-22]。所以細胞內(nèi)水分暫未向外流動就受到溫度載荷作用的影響，形成冰晶，導(dǎo)致細胞機械損傷。結(jié)冰溫度隨降溫速率的增加逐漸降低，結(jié)冰時間隨降溫速率增加而減小。在1 ℃/min到90 ℃/min降溫速率變化中，當(dāng)降溫速率<8 ℃/min時，結(jié)冰時間變化幅度大。而當(dāng)降溫速率>8 ℃/min時，結(jié)冰時間變化較小，見圖4。

圖2 蘋果組織細胞變化情況Figure 2 Changes of apple tissue cells

圖3 不同降溫速率下蘋果細胞的凍結(jié)時間與持續(xù)時間Figure 3 Freezing time and duration of apple cells at different cooling rates

圖4 結(jié)冰溫度Figure 4 Freezing temperature

2.3 蘋果細胞的一維形態(tài)學(xué)參數(shù)分析

由圖5、圖6可知，蘋果細胞周長變化量和當(dāng)量直徑隨降溫速率的增大呈先驟降后增大的趨勢。蘋果組織細胞在1 ℃/min的降溫速率下周長變化量和當(dāng)量直徑變化量最大是11.9%，在90 ℃/min的降溫速率下周長變化量最大是11.2%，變化均大于10%。由于水形成冰時體積要增大9%～10%，細胞必受到機械損傷[23]，當(dāng)冷卻速率比較小或者超級大時，蘋果細胞內(nèi)形成塊狀大冰晶，細胞變形度增大，細胞組織損傷嚴重，果蔬品質(zhì)降低。當(dāng)在2 ℃/min 到20 ℃/min降溫速率區(qū)間時，蘋果細胞變形度均小于4%，認定組織細胞狀態(tài)較好，是因為有細胞壁的保護，果蔬細胞仍具有良好柔韌性。當(dāng)在低于2 ℃/min 和高于20 ℃/min降溫速率區(qū)間時，對細胞機械損傷較大，見圖5～圖7。

圖5 蘋果細胞周長變化量Figure 5 Variation of cell perimeter in apple

圖6 蘋果細胞當(dāng)量直徑變化量Figure 6 Changes in the equivalent diameter of apple cells

圖7 蘋果細胞變形度Figure 7 Degree of cell deformation in apple

2.4 蘋果細胞的二維形態(tài)學(xué)參數(shù)分析

由圖8可知，細胞面積變化量隨降溫速率的不斷增大先減小后增大。蘋果面積變化量最高37.69%是在降溫速率為90 ℃/min的降溫過程中，此時細胞損傷嚴重。蘋果面積變化量在10%以下說明細胞損傷小，由圖8可知，在2 ℃/min到20 ℃/min的降溫過程中，蘋果面積變化量<10%。由圖9 可知，在降溫速率比較低的情況下，蘋果細胞圓度變化呈波動狀態(tài)，前后差距明顯。在高于20 ℃/min的降溫過程中，伴隨著降溫速率的增加，蘋果細胞圓度波動變小，走勢愈加緩慢。

圖8 蘋果細胞面積變化量Figure 8 Change in cell area of apple

圖9 蘋果細胞圓度變化量Figure 9 Changes of apple cell roundness

2.5 蘋果細胞的三維形態(tài)學(xué)參數(shù)

細胞受均勻溫度載荷時，細胞形變和細胞內(nèi)壓的變化具有相關(guān)性[24]，由圖10可知，在90 ℃/min的降溫速率下，因為降溫速率比較高，水分快速凍結(jié)導(dǎo)致冰晶體的出現(xiàn)和生長。由于水形成冰時體積會變成原來的1.1～1.2倍[25]，故體積變化大，變化量高達37.4%。由圖11可知，在1 ℃/min的降溫速率下，因為緩慢凍結(jié)，細胞在滲透壓作用下流失水分，冰晶持續(xù)長大擠壓細胞間隙[26-27]，導(dǎo)致體積變化，體積變化量高達28%。結(jié)合圖10 和圖11可知，在10 ℃/min降溫速率處細胞體積變化量都達到最小狀態(tài)，僅為2.8%和1.69%。

圖10 蘋果細胞體積變化量Figure 10 Changes of cell volume in apple

圖11 蘋果細胞內(nèi)壓變化量Figure 11 Changes of intracellular pressure in apple cells

綜上，細胞形態(tài)學(xué)參數(shù)變化量>10%的細胞損傷嚴重，故在9種不同降溫速率中舍棄使參數(shù)變化量在10%以上的降溫速率，得出10 ℃/min是其最佳降溫速率。

3 結(jié)論

對蘋果細胞在1，2，5，8，10，15，20，50，90 ℃/min的冷卻速率下進行細胞結(jié)構(gòu)觀測，研究細胞損傷機理，得出以下結(jié)論：

(1) 在處理蘋果冷凍冷藏過程中引發(fā)的果蔬細胞損傷問題時，利用得到的蘋果細胞最佳降溫速率，可以更好地避免溫度載荷造成的細胞損傷，盡量減少蘋果干耗問題，提高蘋果的實用價值和商業(yè)價值。

(2) 蘋果細胞的結(jié)冰溫度隨冷凍速率的增加而降低，凍結(jié)時間也大大縮短。在1 ℃/min到90 ℃/min的降溫區(qū)間中，溫度降幅達49.37%，而對應(yīng)的結(jié)冰時間僅為原來的1.7%。

(3) 隨著降溫速率的不斷增大，蘋果細胞周長、面積和體積均是先減小后增大的趨勢。細胞內(nèi)壓隨細胞體積而變化。

(4) 最好在貯運過程將降溫度速率控制在10～20 ℃/min。