自體月經血來源的干細胞在宮腔粘連中的臨床應用

馬海蘭，陸蘭英，王巍，劉夢婷，何梅，李美玲

1.桂平市人民醫院生殖醫學中心，廣西桂平 537200；2.武漢漢密頓生物科技股份有限公司，湖北武漢 430000

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）是子宮內膜基底層損傷后功能層再生修復障礙、纖維瘢痕組織形成導致宮腔部分或完全封閉。主要癥狀為月經量少，甚至閉經、不孕等[1]。目前臨床治療IUA以手術為主，輔以子宮內膜再生修復和增加子宮內膜血流等綜合管理。對中重度粘連患者來說，術后粘連復發、內膜再生障礙等仍不能有效避免，宮腔粘連術后總體復發率為3.1%～23.5%，其中重度粘連高達62.5%[2]。本課題旨在探究2018年4月—2021年4月于桂平市人民醫院就診的因宮腔粘連導致不孕的50例患者，經自體月經血來源的干細胞移植后的臨床應用效果。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究獲醫院倫理委員會批準。所有參與者在充分了解細節、失敗可能性和程序風險后簽署知情同意書。選取于本院就診的50例不孕患者為研究對象。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①年齡22～40歲；②接受“試管嬰兒”助孕治療、移植2次以上失敗；③2次宮腔鏡證實為宮腔中、重度粘連[按照歐洲婦科內鏡協會IUA分類標 準（european society of gynecological endoscopy，ESGE）]；④傳統治療手段后內膜厚度＜6 mm（B超檢查評估）。排除標準：①合并泌尿生殖系急性炎癥患者；②合并活動性生殖器結核患者。

1.3 IUA分類標準

Ⅰ度：宮腔內多處有纖細膜樣粘連帶，兩側宮角及輸卵管開口正常；Ⅱ度：子宮前后壁間有致密的纖維束粘連，兩側宮角及輸卵管開口可見；Ⅲ度：纖維索狀粘連致部分宮腔及一側宮角閉鎖；Ⅳ度：纖維索狀粘連致部分宮腔及兩側宮角閉鎖；Ⅴa度：粘連帶瘢痕化致宮腔極度變形及狹窄；Ⅴb：粘連帶瘢痕化致宮腔完全消失。其中，Ⅰ～Ⅱ度為輕度粘連，Ⅲ度為中度粘連，Ⅳ～Ⅴ度為重度粘連[3]。

1.4 方法

1.4.1 常規治療 宮腔鏡術后予常規雌孕激素序貫療法，于月經第5日開始服用戊酸雌二醇片（國藥準字號J20130009，1 mg/片），2次/d，2片/次，連服22 d，于最后10 d加用地屈孕酮片（注冊證號H20130110，10 mg/片）治療，2次/d，10 mg/次。重復3個周期。

1.4.2 自體月經血來源的干細胞治療 在常規治療后采用自體月經血來源的干細胞進行宮腔內局部移植治療。具體方法如下。

（1）月經血收集。患者于月經前檢查陰道、宮頸分泌物，無細菌、真菌、支原體、衣原體感染；月經期第2天碘伏消毒外陰、陰道，用肝素鈉潤洗月經杯，并置于陰道內穹隆扣住子宮頸，收集12 h內月經血3～10 mL，將經血與磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（含antibiotic-antimycotic）等體積稀釋后，送至武漢漢密頓生物科技股份有限公司分離培養內膜干細胞并冷凍保存，擇期送回本院胚胎培養室繼續冷凍保存。

（2）經血來源的干細胞(menstrual blood-derived stem cells，MenSCs)的收集與分離。將稀釋后的血液沿著盛有1/2體積的Ficoll（GE Healthcare）分離液的離心管上管壁緩慢加入，室溫900×g，離心30 min。無菌巴氏吸管緩慢吸取中間層細胞，置于約2倍體積的PBS溶液中，室溫300×g，離心10 min。棄上清，PBS再次清洗2次，留取細胞沉淀。

（3）MenSCs的培養與擴增。①原代培養：細胞隨后放于含antibiotic-antimycotic的無血清培養基中培養。24 h后PBS溶液洗滌除去未貼壁細胞，貼壁細胞記做P0代。

②傳代培養與凍存建庫：每隔3～5 d更換培養基，細胞融合度達到80%～90%時消化傳代。棄培養液，PBS清洗細胞一遍，加入0.25%的胰酶，37℃孵育3 min，待細胞變圓，輕輕拍打瓶身使MenSCs全部脫落，加入全培養基終止消化，收集細胞，1 000 r/min，離心5 min，收集沉淀用新鮮培養液重懸細胞至所需細胞濃度，移至新的培養瓶，置于37℃、5%CO2細胞培養箱傳代培養。重復上述操作，將細胞培養傳代至P4代，收集后建立工作細胞庫，凍存待用。

（4）MenSCs的檢測與鑒定。①微生物檢測：細胞上清液進行細菌、真菌、支原體、內毒素檢測。一旦檢測到有微生物污染，細胞應立即丟棄。

②MenSCs的表面標志物鑒定：取生長狀態良好的細胞，將細胞消化分散成單個細胞，并平均分成7份置于流式管，每份1×106個細胞，按要求分別加入以下流式抗體：CD73、CD90、CD105、CD44、CD34、CD45、CD19、HLA-DR，室溫避光孵育30 min，按要求上樣及使用流式細胞儀。

③MenSCs誘導分化：取生長狀態良好的細胞，將細胞消化分散成單個細胞懸液，按1×106/孔，均勻鋪在6孔板。細胞貼壁后更換成脂、成骨、成軟骨誘導培養基。每3～4天更換培養基。培養2～3周后分別進行油紅O(Oil Red O)、茜素紅(Alizarin Red)、阿利新藍(Alcian blue)染色鑒定MenSCs的分化潛能。見圖1。

圖1 MenSCs特征。A是P0及P4的圖像（scale bar=50 μm）；B是流式細胞測定MenSCs的陽性表面標志物CD73,CD105和CD90，以及陰性表面標志物CD34,CD45和HLA-D1；C分別是油紅O(左)、茜素紅(右)染色鑒定的成脂、成骨誘導分化的MenSCs。MenSCs為月經血干細胞

（5）MenSCs解凍。月經期第2天，通知患者準備移植干細胞。核對患者信息后，將已凍存的干細胞在37℃水浴中復蘇2 min，吸到8 mL生理鹽水中，120 g，離心5 min；用3 mL生理鹽水重懸細胞，細胞計數后調整濃度至（3～4）×106/mL，用3支1 mL注射器分別吸取1 mL備用。

（6）MenSCs移植。患者取截石位，碘伏常規消毒外陰及陰道，無菌紗布擦干陰道、宮頸及陰道穹隆部，移植前輕微地搔刮子宮腔清除子宮腔內殘留的內膜層凝血塊。在腹部B超引導下，經宮頸管插入胚胎移植管達子宮內膜基底層下0.5 cm，取出管芯，接5 mL裝生理鹽水注射器，加壓推注有阻力，再接裝有1 mL干細胞懸液的注射器，緩慢注射細胞懸液0.5 mL，緩慢撤回移植管，同時繼續注射剩余的0.5 mL細胞懸液直到尖端退出子宮內膜外。選取另外兩個位點，重復移植操作2次。術后患者屈膝平躺2 h，術中靜脈輸注250 mL生理鹽水+間苯三酚(40 mg/支，國藥準字H20046766)40 mg抑制子宮收縮。

（7）激素療法。采用激素替代療法刺激子宮內膜生長，患者于干細胞移植日開始口服芬嗎通（紅片為雌二醇片2 mg/片；黃片為雌二醇地屈孕酮片，每片含雌二醇2 mg和地屈孕酮10 mg）。先服芬嗎通紅片，1片/次，3次/d，連服14 d后給予芬嗎通黃片口服，1片/次，3次/d，服14 d停藥。待撤退性出血第3天，重復第2周期激素療法。于服用芬嗎通紅片后第12天行B超檢查子宮內膜厚度及形態，若子宮內膜厚度＜7 mm則予芬嗎通黃片口服，1片/次，3次/d，服14 d停藥，于撤退性出血后再重復第3個周期激素療法。如子宮內膜厚度仍＜7 mm，則考慮進行第二輪MenSCs移植治療。在第2周期激素療法過程中，若子宮內膜厚度＞7 mm，且內膜形態為A型或B型說明達到預期效果，繼續口服芬嗎通紅片,1片/次，3次/d，連續3 d，抽血查性激素雌二醇＞200 pg/mL，孕酮＜1.0 ng/mL，即予黃體酮肌內注射，60 mg/d（20 mg/支，國藥準字H33020828），持續注射4 d，予移植D3胚胎或注射6 d，予移植D5、D6囊胚。

1.4.3 胚胎移植 移植后繼續予口服芬嗎通紅片2 mg，3次/d，雪諾同90 mg塞陰道作為黃體支持，移植后10～14 d回院驗孕。

1.5 觀察指標

①月經情況[4]：患者在干細胞治療前后，于經期自行通過月經杯收集經血，記錄1～2個月的月經持續時間及經量。②子宮內膜厚度及形態：采用ALOKA超聲診斷儀F31檢查子宮內膜形態，探頭頻率約是4～9 MHz。子宮內膜厚度測量范圍為：距子宮底1 cm處一側的子宮內膜回聲起始處至另一側子宮內膜回聲起始處。子宮內膜形態分型標準[5]：強回聲區在外層與中央區域出現，低回聲區或暗區在外層與宮腔中線之間，呈現“三線征”為A型；均一的中等強回聲，宮腔強回聲中線斷續不清，屬于B型；無宮腔中線回聲，且出現均質強回聲區屬于C型。達到A和B型，則認為治療效果良好，可以進行凍融胚胎移植治療。③妊娠結局：于胚胎移植后第10～14天抽血查人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG），HCG＞25 U/L則診斷為生化妊娠。于胚胎移植后28 d行陰道B超檢查，查見宮腔內孕囊及原始心管搏動，則診斷為臨床妊娠，即為妊娠成功。

1.6 統計方法

采用SPSS 19.0統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量資料以(xˉ±s)表示，組間差異比較采用t檢驗；計數資料以[n(%)]表示，組間差異比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者治療前后經期、經量、內膜厚度比較

治療后，患者經期、經量及內膜厚度明顯高于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 患者治療前后經期、經量、內膜厚度比較(±s)

表1 患者治療前后經期、經量、內膜厚度比較(±s)

項目經量（mL）內膜厚度（mm）經期（d）治療前11.76±6.93 4.86±0.74 3.22±1.83治療后32.28±13.84 7.45±0.87 4.34±1.28 t值14.49 31.27 7.89 P值＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 患者治療前后子宮內膜厚度及形態比較

患者治療后子宮內膜形態較治療前明顯改善，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 患者治療前后子宮內膜形態比較

2.3 患者治療后妊娠結局

治療后，有27例仍未妊娠，23例臨床妊娠（妊娠率46%），其中3例雙胎妊娠，余為單胎妊娠。

3 討論

IUA由Asherman首次對該疾病進行命名并作詳細描述，因此也稱Ashmen's綜合征[6]。IUA是繼發性不孕患者常見的病因，占不孕癥發病原因的8%[7]。有學者提出，IUA的發生與子宮內膜干細胞減少、缺失、功能缺陷有關[8]。

強大的再生修復能力是子宮內膜的主要特點。子宮內膜基底層受損是子宮內膜再生修復障礙主要原因。相關研究表明，子宮內膜再生修復的來源主要是子宮內膜干細胞存在于子宮內膜基底層[9]。2004年，Chan等[10]首次利用細胞克隆技術從子宮內膜組織單細胞懸液中培養出上皮細胞和間質細胞克隆，證實子宮內膜中存在干細胞。胡嘉[11]研究關于從健康生育年齡女性的月經血分離得到內膜干細胞，并證明該細胞具有超強的增殖能力，認為此細胞在內膜的再生中有重要作用。當嚴重的內膜損傷如子宮內膜電切術、產后刮宮創傷、子宮內膜炎等均可以導致子宮內膜干細胞數量減少或功能受損，內膜無法完全再生并瘢痕化，最終導致IUA。

干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞，不同來源的干細胞如骨髓干細胞、胚胎干細胞、臍帶血干細胞和月經血來源干細胞等都有用于治療IUA的研究報道。Santamaria等[12]研究自體移植CD133陽性的骨髓來源干細胞在治療難治性IUA和子宮內膜萎縮中的療效，16位患者中，15個恢復了月經，其中2名分娩足月兒。Cao等[13]將加載人臍帶血間充質干細胞的可降解膠原支架移植到IUA復發者的宮腔，患者子宮內膜平均厚度增加，妊娠率約為40%（10/26）。前期，臨床治療IUA的應用中以骨髓來源的干細胞為主，但骨髓干細胞的收集具有侵入性，細胞的增殖能力隨年齡增長而下降，患者接受性差等缺陷限制其在臨床中的應用。

MenSCs和骨髓間充質干細胞相比，有相似的表型和特性，如呈長梭形旋渦狀生長，細胞表面分子和三胚層分化能力。MenSCs表達間充質干細胞表面分子CD105、CD73、CD90、CD29，不表達造血干細胞表面分子CD34、CD45和CD133。然而，有研究報道MenSCs表達其他來源間充質干細胞不表達的多能胚胎干細胞表面標記分子，如SSEA-4、Nanog、Oct-4[14]。研究證實，MenSCs經體外誘導培養，可以向脂肪、成骨、內皮、心肌、神經、呼吸上皮、肝臟等細胞分化[15]。MenSCs還具有免疫調節作用。在潰瘍性腸炎小鼠中，MenSCs減少炎癥細胞，如巨噬細胞、NK細胞的浸潤，降低炎癥因子IL-2和TNF-α的含量而升高IL-4及IL-10的含量[16]。有學者在電損傷致小鼠IUA模型中靜脈注射人來源的MenSCs，MenSCs能夠顯著增加內膜厚度，促進血管生成，懷孕率和胚胎數 量 顯 著 升高[17]。Tan等[18]利 用CD44、CD73、CD90和CD105陽性的月經血干細胞治療7名重度宮腔粘連的患者，所有患者子宮內膜均增厚，1名自然懷孕，2名經胚胎移植后成功懷孕。

本研究結果顯示，50例患者，宮腔移植CD73、CD105和CD90陽性的MenSCs后，經期、經量均較治療前有不同程度的增加；子宮內膜厚度較治療前增厚[（4.86±0.75）mm vs（7.45±0.87）mm）]；子宮內膜形態較治療前明顯好轉（P＜0.001）。相關學者利用含有CD73、CD90和CD105陽性的月經血干細胞治療重度宮腔粘連患者，所有患者子宮內膜均增厚的研究結果一致[19]。本研究50例患者中有23例臨床妊娠（妊娠率46%），其中3例雙胎妊娠，余為單胎妊娠。本研究的局限性在于妊娠結局不理想，可能與移植后子宮內膜中植入的MenSCs數量較少有關。移植后的干細胞聚集在受損的子宮內膜區域，自我復制并分化成為新的細胞亞群，增加子宮內膜腺體的數量，減少纖維化形成。研究表明，MenSCs在體內移植部位并沒有大量的植入或分化，而是通過旁分泌機制增強組織修復或限制組織破壞[20]。基于此在后續的研究中，可以嘗試聯合使用細胞因子，如粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF），通過細胞因子的促進血管生產、抗細胞凋亡、抑制炎癥反應、免疫調節等作用，增加子宮內膜厚度，改善子宮內膜容受性。黃偉媚等[20]通過盆底功能障礙治療儀結合G-CSF宮腔灌注治療60例患者，改善患者子宮內膜容受性，增加內膜厚度，同時還需區分非整倍體胚胎引起的妊娠丟失。

IUA的發生是多因素相互作用的結果，治療與預防該病的復發仍然是當前面臨的一個巨大的醫學挑戰，而基于干細胞治療的再生醫學為其創造條件，特別是MenSCs，來源廣泛，其可從女性月經血中直接獲取，易于收集、高增殖能力、多向分化潛能、低免疫原性，且不涉及倫理道德問題等優點，還可分泌多種抗炎細胞因子，具有更多的應用前景。但是目前干細胞治療IUA的研究還處在初級階段，研究數據有限，對干細胞治療的安全性及如何提高干細胞治療技術中移植細胞的歸巢率及存活率尚不能明確，需要大樣本的臨床數據進一步驗證。相信隨著研究的進一步深入，基于間充質干細胞的子宮內膜修復和治療將會更準確、有效。

綜上所述，經血干細胞治療IUA的安全性，并且可以促進內膜再生，增加IUA不孕患者的懷孕概率。