免疫熒光雙重染色在結(jié)核分枝桿菌肺炎患者中的診斷應(yīng)用

王仁德

肺結(jié)核（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌所引起的一種慢性傳染病，目前仍是威脅全球公共衛(wèi)生健康的重大傳染病[1]。當(dāng)前由于各種因素的影響，結(jié)核分枝桿菌肺炎的發(fā)病例數(shù)依然較多，可嚴(yán)重影響患者的身心健康[2]。當(dāng)前隨著現(xiàn)代結(jié)核病控制策略的廣泛實(shí)施，結(jié)核分枝桿菌肺炎的死亡率有了明顯下降，但是治療周期仍然維持在12 個(gè)月左右，導(dǎo)致患者依從性差，治愈率不盡人意，為此加強(qiáng)早期診斷具有重要價(jià)值[3]。當(dāng)前對(duì)于結(jié)核分枝桿菌肺炎的診斷方法主要為體外分離培養(yǎng)和涂片鏡檢，雖然準(zhǔn)確率比較高，但是存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、敏感性低等不足[4]。結(jié)核分枝桿菌肺炎的免疫診斷具有簡(jiǎn)單、快速、敏感性高、特異性高等優(yōu)勢(shì)，主要依靠結(jié)核分枝桿菌肺炎侵入宿主的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答而設(shè)計(jì)，但是很難鑒別結(jié)核分枝桿菌感染與環(huán)境中非結(jié)核分枝桿菌和接種卡介苗后的致敏狀況[5-6]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，免疫熒光雙重染色得到了廣泛應(yīng)用，其可根據(jù)待測(cè)物的特性以及檢測(cè)的具體條件，篩選出最合適的檢測(cè)方法，通過(guò)測(cè)定復(fù)合物上標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度，即可確定樣品中待測(cè)抗原含量，從而進(jìn)行臨床診斷[7]。本文具體探討與分析了免疫熒光雙重染色在結(jié)核分枝桿菌肺炎患者中的診斷應(yīng)用，以促進(jìn)免疫熒光雙重染色的臨床應(yīng)用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年3 月-2021 年3 月在佳木斯市腫瘤醫(yī)院診治的結(jié)核分枝桿菌肺炎患者66 例作為結(jié)核組，同期選擇非結(jié)核分枝桿菌肺炎患者66 例作為非結(jié)核組。納入標(biāo)準(zhǔn)：兩組患者均符合肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；結(jié)核組直接痰涂片鏡檢2 次痰菌陽(yáng)性，胸片顯示有活動(dòng)性肺結(jié)核病變陰影；病程≥3 年；年齡20～80 歲；小學(xué)及以上文化水平。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠與哺乳期婦女；合并有腫瘤的患者；合并有其他傳染性疾病的患者；診治期間死亡的患者；臨床資料缺乏的患者；不配合調(diào)查的患者；合并有精神疾病患者；標(biāo)本污染或懷疑污染者。患者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集所有患者的胸腔積液標(biāo)本，患者完成鹽酸利多卡因局部麻醉后，超聲引導(dǎo)下胸腔穿刺引流進(jìn)行采集標(biāo)本（≥5 mL），把采集的標(biāo)本分為三份，保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 涂片鏡檢-熒光染色法檢測(cè) 取所有患者第一份樣本，渦旋振蕩混勻后吸取5 mL 到無(wú)菌離心管中，按照體積比1︰1 加入濃度為4.0%的氫氧化鈉溶液。液化樣本后，室溫靜置15 min，3 000 r/min 離心10 min。取沉淀涂抹于玻片正面，干燥后進(jìn)行熒光染色鏡檢。熒光染色鏡檢過(guò)程包括初染-脫色-復(fù)染，然后進(jìn)行熒光顯微鏡鏡下觀察，在×40 物鏡下觀察結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)并計(jì)數(shù)。

1.2.2.2 免疫熒光雙重染色法檢測(cè) 取第二份樣本行免疫熒光雙重染色法染色，熒光標(biāo)記物為以FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG 兔抗結(jié)核分枝桿菌多克隆抗體PPD 和以Cy5 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 鼠抗ESA-T-6 單克隆抗體。免疫熒光雙重染色后采用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，雙重?zé)晒鈽?biāo)記選用波長(zhǎng)為405 nm和635 nm，采用雙通道同時(shí)接收信號(hào)成像。所有檢測(cè)結(jié)果都由檢驗(yàn)科資深醫(yī)師（工作年限≥10 年，職稱(chēng)為副高及其以上）進(jìn)行判定。同時(shí)取所有患者的第三份樣本進(jìn)行胸腔積液生化指標(biāo)檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括胸腔積液腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、總蛋白（total protein，TP）、葡萄糖（glutamate，GLU）等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組肺炎病程、受教育年限、體重指數(shù)、性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組胸腔積液標(biāo)本生化指標(biāo)比較 結(jié)核組的ADA、LDH、TP、GLU 水平均高于非結(jié)核組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組胸腔積液標(biāo)本生化指標(biāo)比較（±s）

表2 兩組胸腔積液標(biāo)本生化指標(biāo)比較（±s）

2.3 不同方法結(jié)核分枝桿菌檢出率比較 在66 例結(jié)核分枝桿菌肺炎患者中，涂片鏡檢-熒光染色法檢出57 例，檢出率為86.4%（57/66）；免疫熒光雙重染色法檢出65 例，檢出率為98.5%（65/66），不同方法結(jié)核分枝桿菌檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.033，P=0.005）。

2.4 診斷敏感度與特異度 在兩組132 例患者中，涂片鏡檢-熒光染色法的診斷敏感度與特異度分別為84.8%和98.5%，免疫熒光雙重染色法的診斷敏感度與特異度分別為98.5%和100%，見(jiàn)表3。ROC 分析顯示涂片鏡檢-熒光染色法與免疫熒光雙重染色法的曲線下面積分別為0.822 和0.984。見(jiàn)圖1、2。

表3 不同方法在結(jié)核分枝桿菌肺炎患者診斷中的敏感度與特異度（例）

圖1 涂片鏡檢-熒光染色法診斷結(jié)核分枝桿菌肺炎的ROC曲線

3 討論

圖2 免疫熒光雙重染色法診斷結(jié)核分枝桿菌肺炎的ROC曲線

結(jié)核分枝桿菌肺炎是一種由空氣傳播的慢性傳染性疾病，當(dāng)前由于流動(dòng)人口增多以及耐藥結(jié)核病的發(fā)展，使得結(jié)核分枝桿菌肺炎重新成為人們比較關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[9]。結(jié)核分枝桿菌肺炎與非結(jié)核分枝桿菌肺炎在臨床特征上比較類(lèi)似，癥狀具有復(fù)雜性和特殊性，對(duì)于鑒別診斷的要求比較高[10]。涂片鏡檢-熒光染色法為結(jié)核分枝桿菌的常規(guī)檢測(cè)方法，特別是結(jié)核分枝桿菌對(duì)熒光染料有親和性，從而可以被染上熒光[11]。而進(jìn)行熒光染色鏡檢具有敏感性高、無(wú)汞蒸氣污染、操作成本低、操作過(guò)程簡(jiǎn)單、熒光性強(qiáng)等特點(diǎn)，但是診斷的敏感度有待提高[12]。

胸腔積液生化指標(biāo)檢測(cè)的敏感性更低，存在很多局限性，易出現(xiàn)誤診進(jìn)而影響患者治療[13]?，F(xiàn)代研究表明結(jié)核分枝桿菌為一種胞內(nèi)寄生菌，侵入機(jī)體后可被單核巨噬細(xì)胞吞噬，且機(jī)體受到結(jié)核分枝桿菌感染后，在機(jī)體內(nèi)可出現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，為此進(jìn)行結(jié)核抗原的檢測(cè)具有一定的臨床價(jià)值[14]。本研究顯示結(jié)核組的胸腔積液標(biāo)本ADA、LDH、TP 與GLU 水平均高于非結(jié)核組（P<0.05）；在66 例結(jié)核分枝桿菌肺炎患者中，涂片鏡檢-熒光染色法檢出57 例，檢出率為86.4%；免疫熒光雙重染色法檢出65 例，檢出率為98.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明免疫熒光雙重染色在結(jié)核分枝桿菌肺炎患者中的應(yīng)用具有更高的檢出率。從機(jī)制上分析，結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞學(xué)免疫檢測(cè)也具有快速、高效等特征，其中結(jié)核菌素純化蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）是一種包含有多種不同變性階段蛋白質(zhì)的混合物，已長(zhǎng)期運(yùn)用于結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)[15-16]。但是其單獨(dú)使用的特異性比較差，其許多成分與卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌的抗原成分相同。早期分泌性抗原靶6（early secretory antigen target-6，ESAT-6）由RD1 區(qū)編碼，為結(jié)核分枝桿菌感染早期所分泌的蛋白，只存在于結(jié)核菌群中，為此其檢測(cè)能有效的區(qū)分結(jié)核菌感染和卡介苗接種情況，涂片鏡檢-熒光染色法與免疫熒光雙重染色法的聯(lián)合使用可提高對(duì)于結(jié)合分枝桿菌肺炎的臨床檢出率[17]。

結(jié)核分枝桿菌肺炎的控制是一個(gè)系統(tǒng)的過(guò)程，及時(shí)有效的診斷具有重要價(jià)值。免疫熒光雙重染色分析可利用累加多次激發(fā)后的熒光信號(hào)，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，可提升檢測(cè)準(zhǔn)確度與特異度[18]。ESAT-6可通過(guò)誘導(dǎo)含NLR 家族PYRIN 域蛋白3（NLRP3）炎癥小體的活化，從而引起巨噬細(xì)胞的壞死和炎癥反應(yīng)。PPD 可反應(yīng)機(jī)體的中性粒細(xì)胞變化情況，也可介導(dǎo)分枝桿菌抗原引起的CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)[19]。本研究顯示在兩組132 例患者中，涂片鏡檢-熒光染色法的診斷敏感度與特異度分別為84.8%和98.5%，免疫熒光雙重染色法的診斷敏感度與特異度分別為98.5%和100%；ROC 分析顯示涂片鏡檢-熒光染色法與免疫熒光雙重染色法的曲線下面積分別為0.822 和0.984，表明免疫熒光雙重染色在結(jié)核分枝桿菌肺炎患者中的診斷應(yīng)用具有很高的敏感度與特異度。從機(jī)制上分析，免疫熒光雙重染色可以避免結(jié)核病患者由于免疫應(yīng)答低下導(dǎo)致的免疫檢測(cè)假陰性。同時(shí)激光掃描共聚焦顯微鏡具有高分辨率高、敏感度高等特點(diǎn)，還可通過(guò)累加多次激發(fā)后的熒光信號(hào)，同時(shí)檢測(cè)多種物質(zhì)提高檢測(cè)效率，檢測(cè)過(guò)程不受蛋白類(lèi)物質(zhì)穩(wěn)定性和空間結(jié)構(gòu)的影響，從而具有很高的診斷價(jià)值[20-21]。本研究由于經(jīng)費(fèi)與人力限制，沒(méi)有進(jìn)行大樣本量分析，也沒(méi)有設(shè)置正常對(duì)照組，將在后續(xù)研究中探討。

綜上所述，免疫熒光雙重染色在結(jié)核分枝桿菌肺炎患者中的應(yīng)用診斷敏感度與特異度都在98.0%以上，可提高檢出率，可為結(jié)核分枝桿菌肺炎的早期診斷提供一定的依據(jù)。