結(jié)直腸癌根治術(shù)患者Nrf2、HO-1因子變化及在預(yù)后判斷中的應(yīng)用

徐 偉，望小杰，吳 磊

上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院普外科，上海 201908

隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率日益升高，已在我國(guó)居民消化道惡性腫瘤中位列第三，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素和多步驟的復(fù)雜過(guò)程，而且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后較差，遠(yuǎn)期生存率并不理想[1-2]。因此，了解結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的規(guī)律，并對(duì)此類患者復(fù)發(fā)及死亡風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別及分層，對(duì)尋找特異性分子靶點(diǎn)及靶向藥物，優(yōu)化臨床結(jié)局十分重要[3]。近年來(lái)研究表明，轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)及其信號(hào)通路參與了腫瘤的形成與發(fā)展，同時(shí)其結(jié)合核酸序列上含有一段抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信序列，可激活基因或其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，對(duì)于癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移均具有重要作用，是當(dāng)下研究熱點(diǎn)之一[4-5]。但是，現(xiàn)階段對(duì)Nrf2、血紅素加氧酶-1(HO-1)在結(jié)直腸癌預(yù)后預(yù)測(cè)中的價(jià)值尚不明確，這兩種因子是否也有類似的特性尚缺乏可靠的依據(jù)。基于此，本研究以本院接受腹腔鏡根治術(shù)治療的84例結(jié)直腸癌患者為觀察對(duì)象，并利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織中Nrf2、HO-1的表達(dá)情況，并收集其與臨床特征及預(yù)后相關(guān)的數(shù)據(jù)，旨在探討其可能存在的潛在臨床意義，為臨床實(shí)踐提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2020年1月于上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院接受結(jié)直腸癌根治術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者86例為研究對(duì)象，所有患者年齡在49～76歲，平均(67.13±6.95)歲，術(shù)后進(jìn)行規(guī)范的輔助化療。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前1個(gè)月無(wú)手術(shù)、放療、化療等治療史；(2)均接受由同一組醫(yī)護(hù)人員實(shí)施的規(guī)范性結(jié)直腸癌根治術(shù)[6]，且術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)確診為結(jié)直腸癌；(3)進(jìn)行長(zhǎng)期規(guī)律的門(mén)診復(fù)診和電話隨訪；(4)保留有完整癌組織及距癌組織邊緣>5 cm的正常組織蠟塊標(biāo)本；(5)入組前3個(gè)月未服用過(guò)非甾體類抗炎藥、皮質(zhì)激素藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕產(chǎn)婦或有肺、胃等其他腫瘤的特殊人群；(2)5年內(nèi)有其他惡性腫瘤既往史者；(3)手術(shù)前后缺失血常規(guī)、術(shù)后病理缺失TNM分期等關(guān)鍵數(shù)據(jù)者；(4)免疫組織化學(xué)染色效果不理想者；(5)術(shù)前已轉(zhuǎn)移、接受姑息性切除的患者；(6)危重癥患者(Kamofsky生存質(zhì)量評(píng)分小于60分)。

1.2方法

1.2.1組織切片制作和免疫組織化學(xué)染色 所有患者均選取3個(gè)典型的癌組織和2個(gè)相鄰癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)，經(jīng)10%甲醛固定后制成4 μm厚石蠟切片，參照免疫組織化學(xué)染色按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。切片脫蠟與水化之后，于室溫下進(jìn)行孵育、漂洗、甩干等操作，二氨基聯(lián)苯胺法顯色，并采用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，時(shí)間約2 min，鹽酸酒精分化，流水沖洗返藍(lán)，用梯度濃度的乙醇依次沖洗5 min，入流水2 min，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。采用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，將已得出結(jié)果的結(jié)直腸癌組織中Nrf2、HO-1高表達(dá)組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。嚴(yán)格依據(jù)免疫組織化學(xué)染色試劑盒(購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師分別雙盲閱片，于400倍顯微鏡(奧林巴斯CX23)下觀察，NIS-Elements Br3.0分析軟件計(jì)算吸光度值，并根據(jù)文獻(xiàn)[7]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。Nrf2、HO-1主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色至深褐色，根據(jù)染色強(qiáng)度和染色面積百分比量化蛋白相對(duì)表達(dá)水平。(1)染色面積百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比<6%、6%～<26%、26%～<51%、51%～<76%、≥76%分別判定為0、1、2、3、4分。(2)顯色評(píng)分：染色強(qiáng)度以無(wú)著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別判定為0、1、2、3分。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為最終的評(píng)分，總分范圍0～12分，其中6～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，3～5分為中等陽(yáng)性(++)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，0分為陰性(-)，同時(shí)將中等陽(yáng)性及以下記為“低表達(dá)組”，強(qiáng)陽(yáng)性為“高表達(dá)組”。

1.2.3臨床資料收集及隨訪 采用聯(lián)合自制問(wèn)卷調(diào)查表和臨床病歷，對(duì)納入的86例行腹腔鏡下根治手術(shù)患者的一般資料進(jìn)行詳細(xì)記錄。同時(shí)均要求經(jīng)規(guī)范治療后，采用電話或門(mén)診復(fù)診等方式進(jìn)行隨訪，術(shù)后2年內(nèi)每3個(gè)月隨訪1次，2年以上每半年隨訪1次，隨訪開(kāi)始于手術(shù)當(dāng)日，隨訪截止時(shí)間為2021年7月31日，100%的患者有完整的隨訪信息。無(wú)病生存期(DFS)和總生存期(OS)為主要的研究終點(diǎn)，其中DFS指從隨機(jī)化開(kāi)始到第一次腫瘤復(fù)發(fā)或任何原因所致死亡的時(shí)間，DFS率為DFS內(nèi)存活個(gè)體所占的百分比[8]；OS是指從隨機(jī)化開(kāi)始至任何原因所致死亡的時(shí)間，OS率為OS內(nèi)存活個(gè)體所占的百分比[9]。

2 結(jié) 果

2.1不同病理組織中Nrf2、HO-1免疫組織化學(xué)染色評(píng)分比較 免疫組織化學(xué)染色評(píng)分結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中Nrf2、HO-1的評(píng)分比癌旁組織低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同病理組織中Nrf2、HO-1免疫組織化學(xué)染色評(píng)分比較[M(P25,P75)，分]

2.2結(jié)直腸癌組織中Nrf2、HO-1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)直腸癌組織中Nrf2、HO-1的低表達(dá)率分別為63.95%(55/86)、66.28%(57/86)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中Nrf2、HO-1的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大徑、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)(P>0.05)；而Nrf2、HO-1低表達(dá)患者腫瘤浸潤(rùn)深度T3～T4、脈管浸潤(rùn)及TNM分期Ⅲ期例數(shù)均高于高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 結(jié)直腸癌組織中Nrf2、HO-1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3結(jié)直腸癌組織中Nrf2、HO-1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 86例結(jié)直腸癌患者中，組織中Nrf2、HO-1呈現(xiàn)異常低表達(dá)的患者分別有55、57例，DFS率分別為49.09%(27/55)、50.88%(29/57)，OS率分別為38.18%(21/55)、38.60%(22/57)；Nrf2、HO-1高表達(dá)患者分別有31、29例，DFS率分別為74.19%(23/31)、75.86%(22/29)，OS率分別為67.74%(21/31)、68.97%(20/29)。Kaplan-Meier生存分析顯示，結(jié)直腸癌組織中Nrf2、HO-1低表達(dá)組患者的DFS率、OS率均低于高表達(dá)組(DFS率：Log-rankχ2=5.139、4.970，P=0.022、0.030；OS率：Log-rankχ2=6.936、7.098，P=0.009、0.006)，見(jiàn)圖1～4。將結(jié)直腸癌患者臨床資料及生化指標(biāo)納入Cox單因素分析，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者TNM分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分級(jí)N2～N3、有脈管浸潤(rùn)、浸潤(rùn)深度T3～T4及組織中Nrf2低表達(dá)、HO-1低表達(dá)是DFS和OS的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表3；對(duì)單因素分析結(jié)果中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，TNM分期Ⅲ期及組織中Nrf2低表達(dá)、HO-1低表達(dá)均為結(jié)直腸癌患者DFS和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

圖1 結(jié)直腸癌組織中Nrf2表達(dá)與患者DFS率的關(guān)系

圖2 結(jié)直腸癌組織中HO-1表達(dá)與患者DFS率的關(guān)系

圖3 結(jié)直腸癌組織中Nrf2表達(dá)與患者OS率的關(guān)系

圖4 結(jié)直腸癌組織中HO-1表達(dá)與患者OS率的關(guān)系

表3 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的單因素分析

表4 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的多因素分析

3 討 論

在消化道惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而該病的發(fā)生需經(jīng)歷一個(gè)長(zhǎng)期的發(fā)展過(guò)程，因此早期發(fā)現(xiàn)并明確結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是優(yōu)化患者治療結(jié)局的最可靠方式，尋找簡(jiǎn)單、高效、可重復(fù)的檢查手段是目前臨床研究的重點(diǎn)[10-11]。近年來(lái)，隨著對(duì)抗氧化系統(tǒng)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為似乎與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，考慮可能為氧化應(yīng)激環(huán)境的作用促進(jìn)了腫瘤的血管生成及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12]。AQUILANI等[13]通過(guò)一項(xiàng)回顧性研究證實(shí)，結(jié)直腸癌患者處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而經(jīng)過(guò)奧沙利鉑-氟嘧啶聯(lián)合療法治療后，此類患者抗氧化能力得到顯著提高且生存獲益。YAO等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在所有階段的結(jié)直腸癌患者中，其氧化損傷標(biāo)志物水平升高，而抗氧化標(biāo)志物水平降低，同時(shí)該研究提出氧化-抗氧化概況可作為診斷、治療、生存和復(fù)發(fā)的標(biāo)志物。但上述觀點(diǎn)多停留于研究氧化應(yīng)激在促進(jìn)結(jié)直腸組織癌變的相關(guān)領(lǐng)域，而對(duì)結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后判斷的研究卻報(bào)道較少，且其具體分子機(jī)制仍尚未明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中Nrf2、HO-1的表達(dá)比癌旁組織高(P<0.05)，提示Nrf2、HO-1表達(dá)異常可為輔助判斷結(jié)直腸癌患者發(fā)生、發(fā)展提供一定參考。基于此，本研究擬從氧化應(yīng)激角度探討組織中氧化應(yīng)激因子Nrf2、HO-1的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌根治術(shù)患者臨床病理特征及預(yù)后的可能關(guān)系。

Nrf2/ARE是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，其中Nrf2是該通路家族成員中活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)處于偶合狀態(tài)，并被固定在主要由肌動(dòng)蛋白構(gòu)成的細(xì)胞骨架上，通過(guò)泛素化降解Nrf2而維持細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2處于基礎(chǔ)水平[15]。一旦受到親電試劑刺激后，Keap1/Nrf2解偶聯(lián)，Nrf2發(fā)生磷酸化，并移位至細(xì)胞核，與基因中的Maf蛋白相結(jié)合，形成異二聚體[16]。而異二聚體可與ARE啟動(dòng)子部位結(jié)合，啟動(dòng)下游蛋白酶體、泛素酶及Ⅱ相解毒酶等抗氧化靶基因的表達(dá)。HO-1就是其眾多靶基因中重要的一種，可借助還原型輔酶Ⅱ或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸作為其電子供體，對(duì)醌類及其衍生物產(chǎn)生催化作用，使其失去2個(gè)電子從而被還原為水合醌類，進(jìn)一步阻止了醌類及其衍生物繼續(xù)參與氧化還原反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞免受一系列過(guò)氧化損傷[17]。由于腫瘤微環(huán)境中的氧化應(yīng)激在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用，故探究Nrf2/ARE的第一信號(hào)途徑亦有重要價(jià)值[18-19]。Nrf2/ARE的第一信號(hào)途徑在惡性腫瘤患者中的異常表達(dá)已經(jīng)被明確，但是其在結(jié)直腸癌根治術(shù)患者組織中的表達(dá)研究及對(duì)不良預(yù)后的指向性則涉及不多。在本研究中，通過(guò)分析86例結(jié)直腸癌組織中Nrf2、HO-1表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Nrf2、HO-1的表達(dá)水平在結(jié)直腸癌患者中異常降低。腫瘤浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)、TNM分期都反映惡性腫瘤的遷移發(fā)展能力，而本研究結(jié)果顯示上述臨床病理特征與結(jié)直腸癌根治術(shù)患者組織中Nrf2、HO-1的低表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步的單因素和多因素Cox分析亦證實(shí)，結(jié)直腸癌根治術(shù)患者Nrf2、HO-1的異常低表達(dá)是影響其DFS和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明Nrf2、HO-1在此過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。以上研究結(jié)果均證實(shí)了Nrf2、HO-1在結(jié)直腸癌中扮演著抑癌基因的角色，這與其在胰腺癌[20]、腦膠質(zhì)瘤[21]、非小細(xì)胞肺癌[22]中的效應(yīng)類似。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)86例結(jié)直腸癌患者的生存資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Nrf2、HO-1在結(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá)，證實(shí)了Nrf2、HO-1表達(dá)與多種不良臨床病理特征及患者的不良預(yù)后有關(guān)，這將有助于研究特異性的抗腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥性藥物，亦可能對(duì)此類患者術(shù)后死亡及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)有指導(dǎo)性作用。然而，本研究?jī)H局限于臨床標(biāo)本分析，且樣本量相對(duì)較小，再加之操作測(cè)量誤差等也可能會(huì)影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性；同時(shí)，未對(duì)Nrf2、HO-1介導(dǎo)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探索和驗(yàn)證；盡管如此，本研究所獲得的數(shù)據(jù)成果也為臨床探索Nrf2、HO-1在結(jié)直腸癌中的分子功能及潛在機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。在未來(lái)，本課題組將在細(xì)胞及動(dòng)物水平上，探討Nrf2、HO-1抑制結(jié)直腸癌的潛在分子機(jī)制；同時(shí)也將收集更多臨床標(biāo)本對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。