九香蟲內生曲霉菌次生代謝產物及其抗菌活性研究

徐笑天，姬凌波，段小群*，王宇暉*

1桂林醫學院藥學院，桂林 541199；2中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州 450001

微生物的次生代謝產物是抗菌等多種生物活性成分的來源，具有重大的藥用價值，近年來也成為天然藥物化學研究的熱點[1]。昆蟲共生真菌是指那些全部或部分生活史在宿主昆蟲體內度過、不引起宿主明顯感染癥狀的真菌。它們能分解有機成分為宿主提供營養，幫助宿主抵抗外來微生物侵襲，引起宿主的免疫反應[2,3]。在長期進化過程中，真菌發展出一系列方法適應腸道環境，與宿主形成了穩定的共生關系，它們對宿主的選擇和定殖有一定的特殊性。

九香蟲，俗稱“臭屁蟲”，即兜蝽科昆蟲瓜黑蝽，是藥典收載的一類用藥歷史悠久的昆蟲類中藥，在部分地區也作為一種美味食品。《本草綱目》記載九香蟲“主治膈脘滯氣，脾腎虧損，壯元陽”，可用于腎虛陽痿、腰膝酸軟、胃炎脹痛。研究表明，九香蟲的滋補作用可能與它富含的豐富的維生素、微量元素、磷脂、氨基酸、蛋白質、脂質及N-乙酰多巴胺類物質有關[4,5]。此外，九香蟲提取物對金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌及福氏痢疫桿菌皆有抗菌作用，在其血淋巴中還發現了新型抗菌肽[6]。這些抗菌活性物質可能與九香蟲的胃炎治療相關。九香蟲的抗菌作用提示其內生真菌也可能會產生抗菌活性的次生代謝產物。目前對九香蟲內生真菌及其代謝產物的研究尚缺乏相關報道。本研究選取九香蟲為研究對象，從其腸道中分離得到一株曲霉菌，并采用大米固體培養基進行大規模發酵，對其次生代謝產物進行分離純化和結構鑒定，并測試抗菌活性，以期得到抗菌活性良好的代謝產物，豐富昆蟲內生菌的化學成分和生物活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

質譜由Agilent 6520B Q-TOF質譜儀測定(美國安捷倫儀器有限公司)；核磁數據由Bruker AVIII-500及AVIII-600核磁共振儀(布魯克儀器有限公司)測定(1H NMR：500 MHz和600 MHz；13C NMR：125 MHz和150 MHz)，以TMS作為內標；分析型HPLC為Waters 1525型(Symmetry-C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，流速1.0 mL/min)、半制備型HPLC為Waters 1525型(Zorbax SB-C18，250 mm×9.4 mm，5 μm，流速4.0 mL/min，美國沃特世儀器有限公司)；酶標儀(瑞士帝肯儀器公司)；高壓滅菌鍋(上海申安儀器有限公司)；QYC-200型搖床(上海福瑪儀器有限公司)；正相柱色譜硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20凝膠柱填料(瑞典Pharmacia公司)；MCI柱色譜填料(日本三菱公司)；所用試劑均為分析純(天津富宇精細化工有限公司)；青霉素(上海麥克林生化試劑有限公司)、硫酸鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)；牛肉膏蛋白胨培養基和馬鈴薯葡萄糖固體培養基(北京奧博星生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離

捕捉九香蟲活蟲后將蟲體消毒，取腸道組織，加入組織勻漿器中研碎。將組織液稀釋涂布于馬鈴薯葡萄糖固體培養基(PDA)上，由此分離得到該曲霉菌。在PDA平板上，該菌為棕黃色絨毛狀菌落，表面散布大量孢子，顯微鏡下可見頭狀分生孢子梗和圓形孢子(見圖1)，根據以上形態和顯微特征初步鑒定為曲霉屬真菌。其18S rDNA和ITS序列鑒定由上海生工有限公司完成，利用PCR技術擴增其18S rDNA和ITS序列后進行測序，發現其18S rDNA序列和ITS序列與Aspergillusflavipes(Genbank accession No.KT809365)100%相似，鑒定為曲霉菌Aspergillussp.。菌種保存于桂林醫學院生物技術實驗室(保存編號為Aspergillussp.AJXC5-7)。

圖1 Aspergillus sp.的形態(A)和顯微特征(B，10×40)

1.2.2 發酵、提取與分離

將曲霉菌接種在PDA平板上活化，活化的真菌用刀片切取適量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)基中，在28 ℃和140 r/min培養5天后作為種子液。取500 mL錐形瓶20個，每瓶裝入80 g大米和120 mL蒸餾水，于115 ℃滅菌30 min作為固體發酵培養基。在超凈臺中，每瓶固體培養基加入10 mL種子液，在28 ℃條件下靜置避光培養30天。

固體發酵物用乙酸乙酯提取3次，減壓濃縮獲得浸膏(40.3 g)。浸膏以硅膠柱分段，分別用石油醚-乙酸乙酯洗脫(20∶1→1∶3)，合并后分為8段(A～H)。將E-H段合并上MCI柱，以甲醇-水(10%→100%)洗脫合并為6段(M1～M6)。M3段通過凝膠柱色譜和半制備液相(45%甲醇+0.1%甲酸)進一步分離，得到化合物1(8.3 mg，純度98.8%，tR= 19.5 min)、2(12.5 mg，純度99.0%，tR= 28.8 min)、4(28.5 mg，純度95.7%，tR= 42.8 min)、5(20.4 mg，純度97.4%，tR= 30.7 min)和6(15.3 mg，純度91.4%，tR= 34.7 min)。M1段通過凝膠柱色譜重結晶得到化合物3(265.3 mg，純度97.9%)。

1.2.3 抗菌實驗

抗菌實驗所用病原細菌為金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)，枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)和大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)。所用細菌在牛肉膏蛋白胨培養基平板上37 ℃活化24 h，挑取菌落加入MH培養液(Mueller-Hinton Broth)中，震蕩培養6 h，稀釋菌液至1.0×104～1.0×106CFU/mL備用。待測樣品用二甲基亞砜(DMSO)溶解，用MH培養液稀釋成200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL的待測溶液。空白組加入200 μL MH培養液，陽性組加入100 μL陽性藥溶液和100 μL菌懸液，測試組加入100 μL待測樣品溶液和100 μL菌懸液，生長組加入100 μL MH培養液和100 μL菌懸液。37 ℃條件下培養24 h后，用酶標儀測定530 nm下的OD值，每一組設置3個平行。MIC(最小抑菌濃度)值為菌液OD值下降一半的藥物濃度，利用GraphPad Prism 5軟件統計分析并計算MIC值和SD(標準差)值。

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1 白色固體；HR-ESI-MS：m/z257.078 7[M+Na]+(calcd for C13H14NaO4，257.078 4)，推測分子式為C13H14O4。紅外光譜3 444 cm-1和1 642 cm-1顯示該化合物有羥基和羰基。

圖2 化合物1～6的結構

圖3 化合物1的關鍵HMBC信號

表1 化合物1的NMR數據(500 MHz和125 MHz，CD3OD)

化合物2白色固體；ESI-MS：m/z246.9[M-H]-，分子式為C14H16O4。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.31(1H，br t，H-9)，6.29(1H，br t，H-13)，6.27(1H，br t，H-11)，5.30(1H，s，H-5)，4.54(1H，m，H-2)，3.73(3H，s，H-15)，3.45(2H，s，H-7)，2.43(1H，dd，J=17.0，11.9 Hz，H-3a)，2.39(1H，dd，J=17.1，5.2 Hz，H-3b)，1.43(3H，d，J=6.4 Hz，H-14)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：77.6(C-2)，43.1(C-3)，196.2(C-4)，105.2(C-5)，179.3(C-6)，42.1(C-7)，139.1(C-8)，107.4(C-9)，162.5(C-10)，101.0(C-11)，159.8(C-12)，109.7(C-13)，20.4(C-14)，55.6(C-15)。以上數據與文獻[7,8]報道基本一致，故鑒定化合物2為citreovirenone。

化合物3白色固體；ESI-MS：m/z142.1[M+H]+，分子式為C6H6O4。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：9.05(1H，s，5-OH)，8.02(1H，s，H-6)，6.34(1H，s，H-3)，5.66(1H，t，J=0.6 Hz，OH-7)，4.29(2H，d，J=0.6 Hz，H-7)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：168.2(C-2)，109.9(C-3)，174.0(C-4)，145.8(C-5)，139.3(C-6)，59.5(C-7)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物3為曲酸。

化合物4黃色膠狀物；ESI-MS：m/z397.2[M+H]+，分子式為C18H17ClO8。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：10.93(1H，s，3′-OH)，6.82(1H，br s，H-3)，6.67(1H，br s，H-5)，6.56(1H，s，H-4′)，3.77(3H，s，H-7)，3.72(3H，s，H-9)，3.53(3H，s，H-9′)，2.32(3H，s，H-7′)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ：139.9(C-1)，123.2(C-2)，114.5(C-3)，151.1(C-4)，106.1(C-5)，151.0(C-6)，56.8(C-7)，166.7(C-8)，52.6(C-9)，159.9(C-1′)，105.3(C-2′)，154.1(C-3′)，108.5(C-4′)，144.2(C-5′)，117.6(C-6′)，21.1(C-7′)，170.4(C-8′)，52.4(C-9′)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物4為methyl chloroasterrate。

化合物5無色油狀物；ESI-MS：m/z357.3[M+H]+，分子式為C19H16O7。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.76(2H，d，J=8.7 Hz，H-13和H-17)，7.09(2H，s，H-7和H-11)，6.82(2H，d，J=8.7 Hz，H-14和H-16)，6.34(1H，s，H-5)，3.88(6H，s，H-18和H-19)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：171.9(C-1)，101.8(C-2)，165.0(C-3)，142.9(C-4)，109.0(C-5)，138.3(C-6)，109.2(C-7/C-11)，149.4(C-8/C-10)，125.6(C-9)，122.8(C-12)，130.3(C-13/C-17)，116.2(C-14/C-16)，157.9(C-15)，56.9(C-18/C-19)。以上數據與文獻[13]報道基本一致，故鑒定化合物5為aspulvinone P。

化合物6無色油狀物；ESI-MS：m/z349.3[M+Na]+，分子式為C18H14O7。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.80(2H，d，J=8.6 Hz，H-13和H-17)，7.47(1H，s，H-7)，7.18(1H，dd，J=8.3，1.7 Hz，H-11)，6.81(3H，d，J=8.5 Hz，H-11、H-14和H-16)，6.36(1H，s，H-5)，3.90(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：172.7(C-1)，100.5(C-2)，167.4(C-3)，143.5(C-4)，108.1(C-5)，126.9(C-6)，114.4(C-7)，149.2(C-8)，148.8(C-9)，116.5(C-10)，125.9(C-11)，123.6(C-12)，129.9(C-13/C-17)，116.1(C-14/C-16)，157.4(C-15)，56.5(C-18)。以上數據與文獻[13]報道基本一致，故鑒定化合物6為aspulvinone Q。

2.2 抗菌活性測試

對分得的化合物1～6進行了革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抗菌活性篩選，分別以青霉素和硫酸鏈霉素為陽性對照[14,15]，結果見表2。化合物1對3株細菌無明顯抗菌活性(MIC>100.0 μg/mL)。化合物3和4表現出一定的抑菌活性，MIC值在35.5到67.5 μg/mL之間。

表2 化合物1～6的最小抑菌濃度

3 結論

本研究利用硅膠、MCI、凝膠柱色譜及半制備液相等方法對九香蟲內生曲霉菌的次生代謝產物進行分離純化，從中分離得到6個化合物，包括1個新化合物和5個已知化合物，均為聚酮類化合物，按照結構類型可以進一步細分為吡喃酮類、二苯醚類及丁內酯類。化合物1和2為首次從曲霉菌中分離得到。二苯醚類化合物4表現出一定的抗菌活性，文獻也報道此類化合物有良好的抗菌活性，尤其是一些鹵素取代的作用更強[14]。因此可以對該菌浸膏其他部分的此類化合物開展分離純化，其中不乏具有活性突出的化合物值得探究。文獻報道曲酸(3)具有良好的抗氧化及抗褐變生物活性，可以開展相關的生物活性研究[16,17]。曲霉屬真菌被報道能合成多種結構類型的生物活性物質，但次生代謝產物為非必需物質，產量相對較低，后期可以通過大規模發酵、改良培養基、誘導生物合成及基因組學改造等技術對曲霉屬真的菌次生代謝產物進行深入挖掘，以期獲得更多的良好活性代謝產物，為合理開發利用蟲生真菌資源提供參考。