UPLC指紋圖譜結合多元統計分析的吳茱萸與制吳茱萸成分變化研究

楊文惠，呂渭升，孫冬梅，羅文匯，楊 潔，何民友，潘禮業，李振雨*

1廣東一方制藥有限公司；2廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，佛山 528244；3江西一方天江藥業有限公司，南昌 330000

吳茱萸，始載于《神農本草經》，被列為中品。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實[1]。8～11月果實尚未開裂時，剪下果枝，曬干或低溫干燥，除去枝、葉、果梗等雜質[1]。吳茱萸具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉的作用，臨床用于厥陰頭痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣，經行腹痛，脘腹脹痛，嘔吐吞酸，五更泄瀉[1]?，F代研究表明，吳茱萸具有舒張血管、抗炎、鎮痛、抗菌、中樞保護、止吐止嘔等多種藥理作用[2-5]。吳茱萸與其甘草汁炮制品(以下簡稱“制吳茱萸”)的藥理作用有所不同，其原因可能與吳茱萸炮制前后化學成分的變化有關。吳茱萸經甘草汁炮制后，能降低吳茱萸毒性，緩和燥性[6]。

吳茱萸中的化學成分眾多，藥理活性復雜。其主要的化學成分包括生物堿、苦味素、黃酮和揮發油等[7]。由于中藥中化學成分的多樣性及復雜性，單一成分定量的化學成分質量控制模式不僅缺乏專屬性，而且難以反映中藥的內在質量屬性。因此，需要準確闡述吳茱萸及制吳茱萸中各類成分的變化，總結炮制前后藥效成分變化的規律，才能更全面地解釋其藥理活性與臨床作用的不同。近年來，新儀器、新技術的大量涌現，使得指紋圖譜以及化學模式識別成為中藥材質量研究的主流，指紋圖譜結合化學計量學分析方法對中藥的整體質量控制提供了一種新的思路[8,9]。

本研究采用超高效液相色譜(UPLC)技術，建立吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜，結合相似度評價和多元統計分析方法聚類分析(CA)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)進行綜合評價，從多角度分析吳茱萸炮制前后的差異性成分，初步探討了吳茱萸與制吳茱萸藥理作用與化學成分的相關性，一定程度上闡釋了吳茱萸炮制前后藥理作用改變與化學成分變化之間的聯系，可以為吳茱萸的質量及炮制研究提供數據參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(Waters H-Class，沃特世公司)；YMC Triart C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；萬分之一分析天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)；百萬分之一分析天平(XP26，梅特勒-托利多公司)；百分之一天平(JJ600，常熟市雙杰測試儀器廠)；數控超聲波清洗器(KQ500D，昆山市超聲儀器有限公司)；超純水系統(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)。

1.2 材料

試劑：乙醇(天津市富宇精細化工有限公司，分析純)；甲醇(天津市富宇精細化工有限公司，分析純)；磷酸(天津市富宇精細化工有限公司，色譜純)；乙腈(默克股份有限公司，色譜純)；水為超純水(實驗室自制)。

試藥：檸檬苦素(四川維克奇生物科技有限公司，批號：wkq16030802，含量98%)；吳茱萸堿(中國食品藥品檢定研究院，批號：110802-201710，含量99.6%)；吳茱萸次堿(中國食品藥品檢定研究院，批號：110801-201608，含量99.7%)；去氫吳茱萸堿(上海同田生物技術有限公司，批號：17052721，含量98%)；金絲桃苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：111521-201809，含量94.90%)；綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-202018，含量96.10%)；新綠原酸(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq19021413，含量99.90%)；隱綠原酸(成都普菲德生物技術有限公司，批號：15121701，含量98%)；咖啡酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110885-201703，含量99.70%)。

14批吳茱萸藥材經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定均為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟果實，經檢驗，均符合2020年版《中國藥典》吳茱萸藥材項下的規定，藥材來源信息見表1(其中以S代表吳茱萸，ZS代表制吳茱萸)。

表1 14批吳茱萸來源信息表

2 方法與結果

2.1 制吳茱萸飲片的炮制

取吳茱萸藥材，除去枝、葉、果梗等雜質，即得吳茱萸飲片。參照2020版《中國藥典》“制吳茱萸”項下方法進行炮制[1]：取6 g甘草搗碎，加適量水，煎湯，去渣，加入100 g吳茱萸飲片(即凈吳茱萸)，悶潤吸盡后，炒至微干，取出，干燥，即得14批制吳茱萸飲片(編號ZS1～ZS14，詳見表1)。

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：YMC Triart C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色譜柱；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～9 min，8%A；9～18 min，8%→30%A；18～28 min，30%→80%A；28～33 min，80%→100%A)；流速為0.30 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為1 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

取甘草酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL含50 μg甘草酸對照品溶液；取去氫吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL含去氫吳茱萸堿50 μg、吳茱萸堿50 μg、吳茱萸次堿20 μg的混合對照品溶液Ⅰ；取金絲桃苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL各含金絲桃苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸30 μg的混合對照品溶液Ⅱ。

2.2.3 供試品溶液的制備

取吳茱萸或制吳茱萸樣品粉末(過三號篩)各約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 指紋圖譜方法學考察

2.2.4.1 精密度試驗

取“2.2.3”項下吳茱萸供試品溶液(編號S5)，按“2.2.1”項下確定的色譜條件連續進樣6次，測定指紋圖譜，以去氫吳茱萸堿峰為參照峰S，計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值。結果顯示，各共有峰與S峰的相對保留時間RSD值均小于0.16%；相對峰面積RSD值均小于0.88%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復性試驗

取同一批次的吳茱萸藥材粉末(編號S5)，按“2.2.3”項下確定的供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別進樣測定，以去氫吳茱萸堿峰為參照峰S，計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值。結果顯示，各共有峰與S峰的相對保留時間RSD值均小于0.48%；相對峰面積RSD值均小于1.51%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.3 穩定性試驗

取“2.2.3”項下吳茱萸供試品溶液(編號S5)，按“2.2.1”項下確定的色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣分析，以去氫吳茱萸堿峰為參照峰S，計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值。結果顯示，各共有峰與S峰的相對保留時間RSD值均小于0.47%；相對峰面積RSD值均小于1.74%，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5 吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜的建立

取14批吳茱萸和制吳茱萸樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄各樣品指紋圖譜的色譜圖。導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》，以編號為S1樣品的指紋圖譜為參照圖譜，進行全峰匹配，14批吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜疊加圖見圖1、圖2，以平均數法生成吳茱萸及制吳茱萸對照指紋圖譜(見圖3)。去氫吳茱萸堿為吳茱萸的主要有效成分之一，色譜峰位置居中，且響應較高，與相鄰的色譜峰分離效果較好，因此選擇去氫吳茱萸堿色譜峰為參照峰S，在吳茱萸指紋圖譜中標識出27個共有指紋峰，制吳茱萸指紋圖譜標識出28個共有峰，在保留時間23 min左右，制吳茱萸比吳茱萸多了28號色譜峰，如圖3所示。經與對照品比對，28號色譜峰確定為甘草酸，為制吳茱萸炮制后產生。

圖1 14批吳茱萸指紋圖譜疊加圖

圖2 14批制吳茱萸指紋圖譜疊加圖

圖3 吳茱萸(R1)和制吳茱萸(R2)指紋圖譜共有模式圖

2.2.6 吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜色譜峰的指認

取混合對照品溶液Ⅰ、Ⅱ及吳茱萸、制吳茱萸供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結果見圖4。經與對照品保留時間及紫外吸收光譜比對，確定峰4為新綠原酸；峰9為綠原酸；峰10為隱綠原酸；峰11為咖啡酸；峰13為金絲桃苷；峰16為去氫吳茱萸堿；峰21為吳茱萸堿；峰22為吳茱萸次堿；峰28為甘草酸。

圖4 吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜色譜峰指認

2.2.7 相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》計算14批吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜的相似度(見表2、表3)，結果顯示，14批吳茱萸的相似度在0.680～0.963范圍內；14批制吳茱萸的相似度在0.724～0.962范圍內，來自江西產區(編號S1、S2、S3、S9、ZS1、ZS2、ZS3、ZS9)的吳茱萸及制吳茱萸的相似度較低；來自湖南、廣西產區(編號S4～S8、S10、S11、S12、S14、ZS4～ZS8、ZS10、ZS11、ZS12、ZS14)的吳茱萸及制吳茱萸的相似度較高；說明江西產區的吳茱萸及制吳茱萸質量與廣西、湖南兩個產區的吳茱萸及制吳茱萸質量存在一定差異。廣西、湖南兩個產區的吳茱萸及制吳茱萸雖然也存在一定的差異，但與江西產區相比，差異較小。另外1批湖南產區(編號S13和ZS13)的吳茱萸和制吳茱萸相似度也較低，可能與藥材的采收時間、產地加工方式的差異有關。

表2 14批吳茱萸指紋圖譜相似度評價表

表3 14批制吳茱萸指紋圖譜相似度評價表

2.2.8 吳茱萸和制吳茱萸UPLC指紋圖譜的OPLS-DA分析

正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法，其最大特點是能夠去除自變量X中與分類變量Y無關的數據變異，使分類信息主要集中在一個主成分中，從而讓模型變得簡單和易于解釋，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯。采用正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)可以進行有監督的模式識別，顯示樣本間差異主要由哪些變量引起，尋找差異性標志物[9]，已廣泛應用于中藥材產地、基原、炮制、真偽鑒別等方面[10]。

本研究運用IBM SPSS Statistics 20.0 統計軟件以27個共有峰及制吳茱萸新增的28號峰峰面積為變量對吳茱萸和制吳茱萸進行OPLS-DA分析，通過OPLS-DA的Scores圖(見圖5)可知，吳茱萸和制吳茱萸明顯分為2類；所建立的模型中累積解釋能力參數R2X(cum)為0.995，累積解釋能力參數R2Y(cum)為0.996，預測能力參數Q2(cum)為0.967，這三個參數值均接近于1，表明該模型的擬合準確性好，具有較強的解釋和預測能力；運用統計軟件修改假設檢驗的次數為200次，結果見OPLS-DA的Permutation圖(見圖6)。由圖6可知，R2和Q2截距值分別為0.488和-1.61，所有R2和Q2的左邊的點都低于最右邊的點，說明建立的OPLS-DA模型沒有出現過擬合現象，可以用于吳茱萸及制吳茱萸的模式識別。通過OPLS-DA的S-plot圖(見圖7)結合VIP圖(見圖8)可知，以VIP大于1為顯著影響，共找到6個差異標志物，對其影響顯著性排序，分別為甘草酸>吳茱萸堿>峰3>峰1>綠原酸>峰2，提示這幾個化學成分對于區分吳茱萸和制吳茱萸的貢獻較大，表明這6個化學成分為吳茱萸與制吳茱萸的差異性成分。

圖5 OPLS-DA分析的Score圖

圖6 OPLS-DA分析的Permutation圖

圖7 OPLS-DA分析S-plot圖

圖8 OPLS-DA分析VIP圖

2.2.9 統計學分析

以平均峰面積為變量，對14批吳茱萸和制吳茱萸6個差異成分色譜峰的平均峰面積進行配對t檢驗，繪制出t檢驗圖(見圖9)，P<0.05，表示差異具有統計學意義，結果顯示，吳茱萸炮制后，峰21(吳茱萸堿)平均峰面積明顯降低，P<0.05，峰28(甘草酸)為新增成分，其余5個差異性化學成分的平均峰面積均有不同程度的降低，但無明顯統計學意義。

圖9 6個差異性成分平均峰面積t檢驗圖

3 討論與結論

吳茱萸指紋圖譜的建立，一方面可以對不同產區的吳茱萸質量進行初步的評價，另一方面也能夠明顯區分出吳茱萸與制吳茱萸，吳茱萸指紋圖譜共標識出27個共有色譜峰，制吳茱萸新增共有色譜峰28，為甘草酸，由制吳茱萸炮制后產生，利用此峰可以明顯區分吳茱萸生品和炮制品。相似度評價結果顯示，除4批江西產區的樣品外，其余產地吳茱萸指紋圖譜相似度較高。其中湖南產區出現1批相似度異常，可能與采收時間、產地加工方式的不同有關。通過正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)找到6個差異標志物，對其影響顯著性排序，分別為甘草酸>吳茱萸堿>峰3>峰1>綠原酸>峰2。

中醫理論認為，中藥吳茱萸性熱苦寒，有散熱止痛、降逆止嘔之功，用于治療肝胃虛寒、陰濁上逆所致的頭痛或胃脘疼痛等癥。而甘草性平，味甘，具有補脾益氣，緩急止痛，調和諸藥的作用。因此，吳茱萸經甘草汁炙后，一定程度能降低毒性、緩和燥性，適用于脾胃虛弱者。吳茱萸經甘草汁炮制后除增加甘草酸外，其余5個差異標志物，平均峰面積均呈下降趨勢，有報道指出吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素對人胚腎細胞有一定的毒性作用[11]，因此，吳茱萸炮制后吳茱萸堿等化學成分含量的降低，是制吳茱萸炮制后毒性降低的原因之一。也有研究表明，吳茱萸不同組分均具有毒性，強度為揮發油>全組分>醇提組分>水提組分[12]，因此，制吳茱萸在炮制過程中，由于受熱，揮發油含量降低，使得其毒性減弱，同時，綠原酸等酚酸類成分因熱不穩定，含量降低，也使吳茱萸藥效更加緩和。

本研究采用超高效液相色譜(UPLC)法建立吳茱萸與制吳茱萸指紋圖譜，該方法專屬性強，重復性好，初步探討了吳茱萸與制吳茱萸藥理作用與化學成分的相關性，一定程度上闡釋了吳茱萸炮制前后藥理作用改變與化學成分變化之間的聯系，可以為吳茱萸的質量及炮制研究提供數據參考。